原来基因定位还可以这么玩

        遗传图谱作为经典的研发方法，在功能基因定位中发挥着重要的作用，为群体遗传学的发展做出了巨大贡献。但是，遗传图谱同样面临着一个严峻问题，就是难发高水平文章，即便有全基因组重测序或者简化基因组等高通量测序buff加持，如果无基因精细定位、克隆、验证等工作，冲击5分以上文章略显内容单调。今天图谱君给大家介绍一篇特别的文章，即通过RNA-seq的方法构建遗传图谱，撇开传统思路，将转录组学和遗传图谱结合，共同进行功能基因定位研究，希望各位科研汪能有所收获！

 

背景

        基于DNA水平的重测序和简化基因组测序已经在植物QTL定位研究中广泛应用，但是利用连锁分析进行基因表达研究较少。在这些研究中，将基因表达量作为一个性状指标，可以对表达基因进行QTL分析，同时对基因调控网络进行研究。虽然甜瓜在果实品质性状上存在着广泛的遗传变异，但是对这些性状的基因定位研究却不多。在该研究中，作者构建了甜瓜RIL群体的转录组图谱，首先定位到2个果肉颜色、香味基因，然后对差异表达基因的调控顺式/反式作用元件进行eQTL定位。

材料方法

亲本：414（非甜，浅橙色果肉，难闻气味），Dul（甜味，深橙色果肉，芳香气味）
群体：RIL，大小99
自然群体：148个甜瓜品种（具有多种果肉颜色）
性状考察：129个代谢物含量和挥发性物质含量（如类胡萝卜素、生育酚、可溶性糖、乙烯释放量、果肉颜色、果型等）
图谱构建：隐尔马科夫模型估计重组bin
转录组测序：授粉10-20天，每个line取5株甜瓜的果肉混样提取RNA，Illumina GAII和HiSeq 2000测序
互做网络分析：eQTL互做网络使用Cytoscape 2.8.2

结果分析

1、转录组测序及图谱构建

        每个样品产生5-15M的100bp序列，与参考基因组比对获得82140个SNP，甜瓜基因组预测有27427个基因，本研究共有16000个基因表达。以SNP为基础划bin，所有个体共检测到6636个重组事件，产生3663个bin（图1A），bin的平均长度为72.6kb。遗传图谱构建总图距为2047cM，利用该图谱进行对之前未能挂载染色体的scffold进行挂载，并对部分组装错误进行了纠正（图1B中圆圈）。

图1       A）重组bin图       B）标记间关系热图

2、果实品质性状定位

        利用群体bin信息，对129个果实性状（口味，颜色，香气挥发性化合物）进行标记关联，共检测到241个QTL，QTL的平均区间大小为602kb，70%的QTL包含30个以内基因。同时，通过4个已克隆基因（PH、CmACS7、CmMGL、CmAAT1）的重定位，验证了QTL定位的准确性。

图2      A）果实酸度和     B）果实长度定位结果展示

3、CmThAT 1和CmPPR 1基因定位与验证

        S-methyl thioesters（s甲基硫脂）是一种挥发性脂类，对该性状进行QTL分析，在chr1定位到CmThAT 1基因，为验证CmThAT 1功能，将CmThAT 1转入大肠杆菌进行异源表达，发现转入CmThAT 1的大肠杆菌中s甲基硫脂显著积累。同时发现在RIL群体中，s甲基硫脂的生成量与CmThAT 1基因的表达量呈正相关（r=0.66）。双亲CmThAT 1基因序列多态性分析发现，子代同亲本Dulce多态性一致的个体与同亲本414多态性一致的个体相比，CmThAT 1基因的表达量和s甲基硫脂含量均较高。

图3 A）S-methyl thioesters生物合成过程和B）CmThAT 1定位结果

        类胡萝卜素含量定位到49个QTL，其中chr 8上存在1个共定位基因CmPPR 1（图4A），PPR蛋白家族与叶绿体和线粒体内基因转录后RNA编辑加工相关。双亲CmPPR 1基因外显子内存在5个SNP（3个位非同义突变），通过对148个自然群体材料CmPPR 1基因中非同义突变SNP的单体型与果肉颜色表型相关性分析发现，第1外显子C/G358与果肉白/绿相关，G/T441与浅橙/深橙色相关（图4B）。

图4 A）CmPPR 1基因定位和B）CmPPR 1不同SNP类型的表型

4、CmPPR 1影响叶绿体基因的表达

        在检测到的16000个基因中，8405个基因在子代群体差异表达，对这些基因进行eQTL分析，定位到12703个eQTL，其中34%为顺式eQTL。在反式eQTL的调控网络，CmPPR 1控制着30个基因的表达，其中27个为叶绿体靶向基因。另外，CmPPR 1受MELO3C002382调控，而MELO3C002382控制着33个叶绿体靶向基因。将CmPPR 1和27个叶绿体靶向基因的表达量与叶绿体基因组编码基因的表达量进行相关性分析，发现两者中大部分成负相关关系，说明这27个叶绿体靶向基因可能有着共同的功能通路。

图5 A）CmPPR 1 eQTL调控网络和B）CmPPR 1调控的30个基因与叶绿体基因表达相关性

总结

        转录组遗传图谱不仅可以进行传统的图谱构建和QTL定位，还能够进行子代样品间差异基因的分析，同时，结合遗传图谱与基因表达量的表型结果进行更深一步的eQTL定位，揭示基因间的调控关系和调控网络，更加快速和准确挖掘候选基因。

 

        关于转录组测序进行遗传图谱的构建已有多篇文章报道，图谱君整理了一下，希望能给大家带来一些从未有过的思路！（扫描下方二维码下载文章原文！）