多组学联合分析解析斑马鱼尾鳍位置记忆组织再生新视角

        组织再生需要细胞根据其所在空间位置调控自我更新和分化。位置记忆能使具有再生能力的细胞从未受伤的组织获得空间信息。目前，科学家们认为位置记忆是依赖于某些信号分子的梯度，但有关它们的信息却很少被揭示。在这篇文章中，作者以成年斑马鱼鱼尾为研究模型，并沿着空间轴（近端，中部，远端）对未受伤鱼尾的转录组、蛋白质组和代谢组以及造模后鱼尾的蛋白组进行了定量分析。

 

材料与方法

1、实验材料：
(1)转录组测序：
对沿尾鳍近远中轴三个位置的每个位置进行RNA-seq；近端，中间和远端，每个样本5个生物学重复，总计15个样本。
(2)蛋白组测序：
实施了三次独立的生物实验以量化在未损伤鳍中沿近轴轴线的蛋白质表达。
实验1：收集并汇集来自八只年龄匹配的鱼的近端和远端区域。
实验2：收集并汇集来自20只年龄和性别匹配的鱼的背腹和腹侧 – 远侧区域。
实验3：收集并汇集了来自20只年龄匹配和性别匹配的鱼的近端，中间和远端区域。中间区域仅在实验3中被采样。
(3)代谢组测序：
分别收获近端，中间和远端区域来自六只成年鱼（三只雄性和三只雌性）。
2、实验方法：Illumina 测序；LC-MS；Label Free
3、研究策略：转录组、蛋白组、代谢组

研究结果

        为了鉴定可能参与尾鳍位置记忆的候选分子，本研究对未受伤的斑马鱼尾鳍的近端，中间和远端区域进行了RNA测序(RNA-seq)和无标记定量(LFQ)蛋白质组学(图1A)，共鉴定出566个转录本和238个蛋白质，主要存在于近或远的富集梯度中(图1B)。另外，主成分分析(PCA)显示鳍的近端和远端区域之间的转录物(图1C)和蛋白质(图1D)丰度的变化很大。中间区域的转录本聚集成一个独特的组，但更接近于远端区域(图1C)。差异丰富分子的最大差异发生在近端和远端区域之间，包括1,424个转录本和113个蛋白质(图1E)。因此，基因组的表达在整个尾鳍的近远端轴上存在着定量的差异。

Fig.1. Transcriptomic and proteomic mapping of positional information in uninjured caudal fins.

图1 无损伤尾鳍位置信息的转录和蛋白质组学图谱

        为了确定沿尾鳍近远端轴线差异表达的分子类型，因此对RNA-seq数据进行了GO分析(图2A)。转录因子是细胞识别的主要监管者，因此是位置记忆效应物的最佳候选者。在作者的RNA-seq数据中编码转录因子的693个mRNA中，有53个在尾鳍前缘和末端区域差异表达(图2B)。对应于964个跨膜受体中的80个和222个离子通道蛋白中的55个的RNAs在近端和远端区域之间差异表达。这些命中包括谷氨酸和多巴胺可吸收G蛋白偶联受体和几个Ca2+和K+可渗透通道(图2C和D)。此外，作者发现与先前不涉及生长控制或再生的细胞信号传导途径相关的跨膜蛋白的差异表达，如ephrin和ednrab。RA，WNT和FGF信号传导等几种途径在附肢发育和再生期间已知在生长控制和图案化中的作用，这些信号通路分别包含55，52和41个基因，并确定了12个RA，13个WNT和10个FGF信号传导途径基因相反的转录梯度(图2E-G)。

Fig.2. Complex differential expression of RNAs identified along proximodistal axis of caudal fin.

图2 沿着尾鳍近端轴识别的RNAs的差异表达

        除了遗传编码的线索之外，代谢产物可能有助于位置记忆。另外还发现，几种代谢酶沿尾鳍的近端轴线差异表达，包括aldh1l1。此外，近期富集蛋白的GO分析鉴定出与氨基酸代谢和脂质转运有关的蛋白质(图3A)。使用质谱法分析未损伤尾鳍的近端，中间和远端区域的代谢物，单个鱼鳍样品中共定量出125种代谢物。PCA将近端和远端鱼鳍区域的代谢物富集聚集成不同的组(图3B)。几种代谢产物的丰度在近端和远端区域之间存在差异；26个近端富集，16个远端富集(图3C)。

Fig.3. Metabolites are differentially expressed along the proximodistal axis of the fin.

图3 在鳍的近远端轴上差异表达的代谢产物

        为了检验这种预测，分别于截肢后1、3天(dpa)，在blastema形成期和生长期(图4A）对再生鳍的片段进行LFQ蛋白质组学研究。为了减少鱼类之间的潜在变异，作者从同一条鱼中采集了再生鳍的背侧和腹远端区域(双截肢)。作者发现3061种蛋白质中有97种、11种和2种在0，1和3dpa的背侧和腹侧-远侧位置之间差异表达。在再生过程中不同时间蛋白质表达的PCA显示1和3dpa的样品聚集成不同的组，在近端或远端区域之间几乎没有变化，而在未损伤的鳍(0dpa)中近端和远端区域之间存在更多变异(图4B)。然而，在1dpa差异表达的11种蛋白中，6种在未受损鱼鳍(0dpa)中也差异表达。编码这些蛋白质的三个基因aldh1l1，hsd17b7和muc5.2(图4C)也通过RNA-seq测量发现在未受伤的鳍片中差异表达。UniProt ID F1R4E4的一种无特征蛋白质，是唯一在0，1和3dpa差异表达的蛋白质(图4D)。

Fig.4. Proteomic analyses of proximal and distal regions of regenerating caudal fins identifies proteins that maintain differential expression after injury.

图4 对再生尾鳍近端和远端区域的蛋白质组学分析确定损伤后维持差异表达的蛋白质

总结

        位置记忆赋予再生组织两个关键属性。首先，离身体近端的截肢比远端截肢的再生更快。第二，新的组织是有图案的。只有损伤部位远端的结构才能再生。虽然相当多的研究集中在了解不同的生物体是如何开始再生的，并且计算模型已经预测了位置信息如何调节再生生长，然而关于位置记忆的细胞机制知之甚少。

        跨膜受体Prod1是位置记忆唯一真正的效应者。除Prod1外，小分子维甲酸(RA)也被报道为两栖类肢体位置记忆的效应物。尽管有关Prod1和RA的这些数据，但没有调节位置记忆的分子，在未受伤的附肢中表现出轻微的表达，并且在物种间保守。普遍假设预测位置记忆机制的分子梯度存在于未受伤的附肢中。因此，本研究测定了沿着成年斑马鱼尾鳍近远轴轴线的RNAs，蛋白质和代谢物的全局丰度，鉴定了许多不同的图案分子。这些信息为再生生物学领域提供了丰富的资源。通过一个复杂的成鱼组织的一个轴的基因产物和代谢物的全局模式，并揭示位置记忆的候选效应器。候选物列表提供了一种潜在的标记物和效应因子，它们在成年附肢的再生和器官大小控制中起着至关重要的作用。

        在脊椎动物中，在附肢再生期间适当的图案化受位置记忆的调节一种细胞特性假定依赖于未受伤肢体中分子的梯度。只有一个基因，蝾螈专用，已被证明可以调节位置记忆，并在未受伤的肢体中以梯度表达。确定新的候选人。

        作者绘制了未受伤的斑马鱼尾鳍上RNAs，蛋白质和代谢物的丰度。作者确定了数百个分子梯度，并产生了32个基因和42个代谢物的高信度列表，这些斑马鱼是位置记忆的候选效应子。此外，这里发现的表达模式可能有助于解释如何在复杂的成人组织中保持尺寸稳态和图案。

 

        欢迎与我们的生物信息工程师交流，我们将免费为您设计文章思路方案。