研究标题：Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma
发表杂志：CELL（IF:38.634），2020.6.23
简述：整合高维多组学方法来描述人皮肤鳞状细胞癌特征，确定了肿瘤特异性角化细胞群体以及肿瘤前沿的免疫浸润和异质性。
研究背景
上皮性肿瘤约占人类恶性肿瘤的90%。cSCC作为其中的一种，是美国第二常见的恶性肿瘤，每年发病人数超百万。尽管可以切除治疗，但有高达4%的cSCC会发生淋巴结转移，并且1.5%的患者最终死亡。近期cemiplimab（PD1抑制剂）的上市给与晚期和转移癌患者以希望，但是肿瘤标志物预测响应的阻力和不足迫切需要更好的对肿瘤微环境（TME）进行特征描述。本文结合单细胞测序、空间转录组等技术，揭示cSCC的肿瘤异质性和免疫机制，为肿瘤和免疫动力学研究提供了支持。
研究方法
一、 实验材料
二、 实验技术
单细胞RNA-seq、空间转录组测序、多路复用离子束成像、CRISPR筛选等。
三、实验流程
实验结果
对10例患者手术切除的肿瘤和原位正常皮肤进行scRNA-seq（图1A），共获得48164个单细胞数据。通过无监督聚类分析确定了肿瘤、正常上皮细胞以及基质细胞亚型(图1B)，并且对骨髓细胞亚群和NK&T细胞亚群进行了细分(图1C&D)，所有的亚群都与之前的实体瘤scRNA-seq研究相似。细胞类型的比例分析也反映了细胞处理的一致性(图1E&F)。本研究为cSCC提供了代表性的细胞图谱。
图1|正常皮肤和鳞状细胞癌的单细胞转录图谱
重新聚类正常上皮细胞后，在正常皮肤中观察到3个主要的角质细胞（KC）亚群（基底、循环、分化细胞）。典型相关分析表明肿瘤KCs广泛重现了正常(基底、循环、分化细胞)亚群，在正常皮肤和cSCC中有几个共享的标记基因(图2A-D)。有趣的是，在肿瘤细胞聚类中出现了与正常皮肤无明显关联的第四个KC亚群，即TSK亚群(图2B-D)。事实上，在这一簇与其他肿瘤细胞区别开来的100个基因中，有99个基因在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织。TSK标记基因与细胞运动和细胞外基质分解有关，暗示了它的侵入性（图2E）。TSKs表达经典的上皮-间质转化(EMT)标志物，如VIM和ITGA5(图2F)；但是EMT类似的TSK细胞缺乏经典表达EMT转录因子(图2H)。因此，我们通过单细胞调控网络进行推理和聚类，提名AP1和ETS家族成员为潜在控制TSKs的TFs(图2I)。TSK细胞也表现出较大的EMT评分范围，提示细胞状态具备高可塑性(图2G)，与EMT连续模型一致。基底细胞（Basal）在肿瘤中的发生率约是正常循环细胞的四倍(图2K)。总的来说，cSCC表现出分化失常，基底细胞迅速增殖，并出现表达EMT连锁基因的TSK亚群。
图2|肿瘤角质细胞的异常分化层次
在患者中，肿瘤相关的斑点簇展现出单细胞测序肿瘤KCs的定位基因表达，同时免疫或间质基因与肿瘤临近间质、未受累的间质或附件区域有关联，与大体的cSCC结构一致（图3A）。使用scRNA-seq中TSK标记基因对每个空间转录组斑点评分，显著突出了一个TSK-high簇，包括TSK标记物MMP10（图3B&C）。在具有清晰前沿的肿瘤中，TSK邻近间质富集了癌症相关成纤维细胞 (CAF)和内皮细胞转录本，表明TSK细胞主要位于纤维血管微环境中(图3D)。超过80%的TSK高簇点位于肿瘤前沿，其余的前沿点富集了Basal肿瘤基因(图3E&F)，这种共存关系通过共表达标志物COL17A1的免疫组化得到进一步确认（图3G&H）。此外，炎症反应和干扰素信号基因在非TSK前沿表达，与干扰素相关转录本在肿瘤基底群体中的存在一致(图2E&I)。这些结果确定了TSK、Basal细胞以及TSK近端纤维血管生态位造成的cSCC肿瘤前沿的异质性。
图3|空间转录组反映了前沿异质性
图4|cSCC的免疫景象
利用多重离子束成像（MIBI）技术，在单细胞分辨率下解析TME的空间组织。我们对6例患者的肿瘤前缘进行了18个视野的MIBI扫描，对38个肿瘤和基质/免疫蛋白标志物图像进行分段，确定了55832个细胞(图5A)，并且聚类分析的主要细胞类型与scRNA-seq细胞类型相似（图5B）。间质和免疫组分在肿瘤内和肿瘤间是可变的，12/17的肿瘤患者图像聚类不一致(图5C)。肿瘤内外的CD8 T细胞、Tregs、巨噬细胞和CD4 T细胞存在高度相关性，尤其前两者更甚(图5D)。5/12视野具备足够的细胞进行系统分析CD8 T细胞和Tregs距离(图5F-H)，我们发现了两者的共定位，并且CD8 T细胞的比例也与共定位呈正相关，表明Tregs受到TME的共招募和CD8 T细胞的共定位共同调节，另外CD4 T细胞和巨噬细胞与Tregs共定位(图5I)。成纤维细胞、巨噬细胞和Tregs在肿瘤-间质边缘最丰富，而CD8 T细胞和中性粒细胞被大量排除在肿瘤之外，表明 Treg 定位可能阻止效应淋巴细胞进入肿瘤(图5J&K)。已经被发现可以介导免疫抑制或抗肿瘤活性B细胞是唯一表现出优先浸润的细胞类型。
图5|cSCC中淋巴细胞子集的空间结构
进一步，我们整合scRNA-seq和ST数据来描述前沿邻近肿瘤和TME细胞之间的信号通路(图6A)。基于配体-受体对数据库，TSKs广参与了自分泌和旁分泌相互作用(主要与CAFs、内皮细胞、巨噬细胞和MDSCs)(图6B&C)。我们使用NicheNet和ST对前沿预测为调节TME特异性细胞类型标记的肿瘤KC配体进行优先排序。与TSK-纤维血管生态位一致的是，对CAFs的显著TSK信号通路是由几对TSK-CAF配体-受体对介导的，包括MMP9-LRP1和TNC-SDC1(图6D&E)。此外，TSKs可通过配体-受体对（PGF-FLT1、PGF-NRP2和EFNB1-EPHB4）调节内皮细胞。相反地，内皮细胞和CAFs显著共表达NicheNet预测配体，如TFPI, FN1，和THBS1，这些与TSK受体匹配(图6F&G)。进一步证实TSKs是一种类似EMT的群体。为了判定TSK细胞是否与多变的TME普遍关联，我们调研了TCGA数据库中31种实体瘤数千个转录组数据。我们进一步判定TSK配体是否诱导CAF基因（1）伴随配体CNV缺失，减少CAF基因表达；(2)配体表达和CAF基因的关联(图6H)，这个在过往研究中被证实。另外TSK细胞可以抑制抗肿瘤免疫。虽然这些研究还不明确TSK细胞是内在抵抗还是免疫调节活性起作用，但这个亚群提供了一个提高免疫治疗的目标方向。
图6|与前沿生态位相关联的细胞串扰情景
使用典型的小鼠模型进行肿瘤亚群功能评估，单细胞测序结果发现异种移植SCC细胞的特征与患者样本基本一致（图7A-C）。来自患者和异种移植数据类似TME细胞类型的比较也显示，人和小鼠之间共享标记物高度重叠，只有异种移植的少量脊髓细胞存在微妙差异(图7D&E)。使用患者肿瘤亚群标志物对体外培养的SCC细胞系进行分析，发现体外细胞在基底、循环和TSK评分方面表现出较小的异质性，这也反映了TME是一个肿瘤细胞群出现的条件(图7F)。综上，异种移植模型概括了cSCC ITH的关键特征。
图7|肿瘤角化细胞缺陷的体内CRISPR分析
接下来，使用CRISPR/Cas9技术对3个鳞状细胞癌移植瘤株进行筛选（4个亚群，334个富集基因），评估肿瘤KC亚群的功能作用(图7A)。通过STARS算法，获得38个命中点，其中18个至少被两种细胞系共享(图7F)。特别的，对肿瘤生长重要的基因偏向于在TSK、基底和循环细胞中表达。肿瘤循环KCs特有的参与细胞循环的基因形成了以PCNA和GINS2为中心的最大网络。最大的TSK特异性网络包括ITGB1、FERMT1、CD151、ARPC2、HSP90B1。ITGB1、CD151和 FERMT1的蛋白产物在细胞表面相互作用，介导整合素信号。通过体外实验验证ITGB1、FERMT1和CD151对肿瘤生长的重要性低于体内，证实了如果整合素信号介导与TME的通讯，相关基因在体内肿瘤发生中应该比在体外有更大的依赖性的推断。综上，体内异种移植筛查结合TCGA分析突出了可能控制亚群特异性致瘤功能的关键基因。
文章总结
本文整合单细胞RNA测序、空间转录组和多路离子束成像绘制了人类鳞状细胞癌组成和空间结构的多模式图谱，发现了一个定位于肿瘤前沿的肿瘤特异性角化细胞（TSKs）。TSK在肿瘤微环境的机制探索，体内CRISPR筛选确定的肿瘤亚群致瘤基因网络，为肿瘤和免疫动力学研究提供了极大支持。
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