分类： 基因组测序
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为什么要做调研图
基因组测序现在已经成为生物学研究的一个重要手段，基因组的杂合度和重复序列对后续基因组组装有很大的影响。高杂合的基因组往往无法合并姊妹染色体，导致组装的结果偏大，而重复序列在组装中会被折叠，使组装中出现缺口、错误，导致组装的结果偏小。不同的生物体的基因组之间杂合率和重复序列含量差异巨大，因此在进行基因组测序前往往需要对基因组的特征进行调研，以确定测序方案，周期等。目前常用的调研手段有三种：
  1. 用流式细胞仪测定细胞核内的DNA总量
  2. 用核型分析方法，识别染色体数量、倍性
  3. 用调研图，通过二代测序，估算基因组大小、杂合度、重复序列比例、GC含量等。
不同的技术手段有不同的侧重，其中调研图以低成本，低难度和更多的评估内容成为使用最多的技术手段，同时调研图所测的二代数据还可以用于回比基因组，以评估组装质量。
调研图是基于数学统计学手段获取物种信息的方式，因此对于已经研究的较为清晰的物种——主要是普通二倍体和简单多倍体，其染色体条数、倍性、大概基因组大小是已知的，此时仅选择调研图就足以满足了解基因组特征的需要，但对于多倍体复杂基因组更推荐补充核型分析和流式的结果，以和调研图相互印证补充。
调研图原理(以二倍体调研图为例)
评估基因组大小

调研图最重要的用处是对基因组的大小进行估计。，对于没有测序错误的理想情况下，用测序数据估算基因组大小可以按照这个公式：基因组大小=测序量/reads平均覆盖深度。但由于测序错误的存在，较长的reads非常容易受到错误的影响，而将reads切碎为“长度为k的片段”，即k-mer，能大大减轻这个问题，因此调研图绘制的是k-mer的深度-频率分布图。此时估算基因组大小的公式就变成了：基因组大小=正常kmer数量/k-mer平均覆盖深度。因为错误总是随机出现的，所以这里正常的k-mer数是过滤掉过低频率的k-mer(即错误)后得到的数量。
在理想状态下，K-mer曲线服从泊松分布，即只会出现一个明显的主峰。但对于一个杂合二倍体，主峰前1/2出会出现一个杂合峰，在杂合度较高的时候可能出现高过主峰的情况。下图即为一个高杂合二倍体kmer的频率-深度分布图。主峰后二倍位置内的峰为重复峰。但如果杂合度很低，可能分布图中只有一个峰存在。主峰所代表的就是k-mer平均覆盖深度，用主峰深度代替公式中的k-mer平均覆盖深度即可算得该基因组的大小。

Figure 1，一个二倍体的kmer频率-深度分布图，横轴为深度，纵轴为kmer出现的频率，主峰位于深度100左右，杂合峰位于深度50左右
k-mer也并不是切的越小越好，过短的k-mer将无法保证多数k-mer在基因组中只出现一次，导致主峰深度估计偏大，而较长的k-mer具有跨越更长重复片段的能力，因此k-mer的选择其实是一个平衡错误和重复的过程。通常k的选择为15到21的奇数，既能够保证k-mer的种类能覆盖基因组，又足够小以避免错误的影响。基因组中往往还存在一些重复序列，这些重复序列也会引起kmer的重复，但这些重复的存在虽然会削低主峰的高度，却不会改变主峰的位置，上图主峰后的小峰即为重复峰。
评估杂合率和重复序列
前面已经提到了杂合率的高低对基因组的组装有非常大的影响，那么如何计算基因组的杂合率和重复率呢？通常有两种不同的方法，一种是直接计算峰的面积，即上图中杂合峰和重复峰的面积占总面积的比例，从而估算出杂合率和重复率。另一种是通过模型拟合各个峰。
genomescope21就是一个通过负二项分布拟合基因组k-mer分布来评估基因组特征的工具，其结果被普遍认可。以下图为例，一个二倍体的genomeScope分析结果。
  • 蓝色柱子是kmer的观测值；
  • 橙红色拟合线部分对应着深度过低的kmer，这些kmer被认为是测序错误引入的；
  • 黑色拟合线是除去被认为是错误的部分（橙红色拟合线部分）之后剩下的所有k-mer，这些被认为是可靠的kmer数据；
  • 黄色拟合线被认为来自基因组非重复区域的K-mer分布；
  • 垂直的黑色虚线为预测最低深度峰的整数倍覆盖度；

Figure 2一个二倍体的调研图，横轴是测序深度(覆盖度)，纵轴是k-mer出现的频率，主峰位于100左右。
多倍体调研图
多倍体又分为异源多倍体和同源多倍体，其调研图的情况更为复杂。以四倍体为例，异源四倍体又被称为双二倍体，从k-mer分析的角度来说，其调研图和二倍体并无太大差异。虽然如此，他们的染色体之间仍然存在一定的相似性，所以在主峰二倍的位置上往往存在一个小的凸起，这样的凸起和高重复率的二倍体调研图非常接近。如下图是一个异源四倍体的调研图：

Figure 3一个异源四倍体的调研图，主峰位于212深度，三个峰的比例为1:2:4
同源四倍体的两套亚基因组之间的区别比异源四倍体更为接近，体现在调研图上就是在主峰的二倍位置处有一个明显隆起的峰。如果存在一定的杂合率，调研图上就会存在三个比例为1:2:4的峰，但如果基因组的杂合率很低，杂合峰不明显，此时调研图看起来和二倍体仍然非常接近。
不同的倍性对整套基因组的大小影响不大，所以面对多倍体时，调研图的结果尽量同时结合流式细胞仪或者核型来判断。对于杂合率约在0.5%~20%左右，重复序列不超过约40%的物种，也可以利用smudgeplot软件1对杂合k-mer进行分析，得到可能的物种倍性，从而辅助基因组杂合率和重复序列的估计。
Smudgeplot通过寻找杂合k-mer来研究基因组的倍性，其定义的杂合k-mer对指的是一对k-mer之间只相差一个碱基，且没有第三个k-mer与他们再相差一个碱基(如ATGATCA, ATGCTCA, ATGGTCA)。对于一个AB形式的杂合，smudgeplot试图从所有k-mer中寻找一对杂合k-mer，而对于一个AAB形式的杂合，smudgeplot试图寻找两条相同的k-mer和一条它们的杂合k-mer，在图中表示为更高的亮度。如下图对一个四倍体的smudgeplot分析，可以明显的看出AABB杂合模式附近的k-mer数量明显高于其它k-mer，左上角也描述了这个结果。

Figure 4一个四倍体的smudgeplot分析结果，横轴是杂合k-mer对的深度占总深度的比例，纵轴是所有k-mer对的总深度，二者的交点即代表了不同的杂合结构。交点的亮度代表了落入其中的k-mer数。
需要注意的是，调研图一般需要50x以上的数据对基因组进行评估，在测序深度不足的情况下，调研图可能无法很好的形成真正意义上的峰，此时好的选择是加测数据，重新绘制调研图进行评估。

[1]  Ranallo-Benavidez, T.R., Jaron, K.S. & Schatz, M.C. GenomeScope 2.0 and Smudgeplot for reference-free profiling of polyploid genomes. Nat Commun 11, 1432 (2020).

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