单细胞核+空间转录组揭示膀胱癌免疫治疗预后机制

膀胱癌患者接受免疫治疗后预后效果的好坏仍然是临床上面临的一个主要的挑战。近期NC一篇文章通过单细转录组及空间转录组阐述了对膀胱癌治疗具有反应应答的癌细胞群。获得了在预测对免疫治疗的反应方面更优的marker基因。有助于为患者的治疗提供更理想更优的治疗方案。

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英文题目：An N-Cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery,chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer

中文题目：表达N-Cadherin 2的上皮细胞亚群预测膀胱癌对手术、化疗和免疫治疗的反应

期刊：Nature Communications

IF：12.12

发表时间：2021

文献链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34385456

摘要

术前新辅助化疗（NAC）和免疫检查点治疗（ICT）已经彻底改变了膀胱癌的治疗。然而，从这些模式中获益最多的患者分层仍然是一个主要的临床挑战。作者将人类膀胱癌的单细胞核转录组、空间转录组和单细胞分辨率的空间蛋白组联合分析，确定具有治疗反应预测能力的上皮细胞亚群。这些细胞表达Cadherin12（CDH12，N-Cadherin 2 ）、catenins和其他上皮细胞的标志物。CDH12富集的肿瘤可以定义患者是否接受NAC治疗后预后效果差。富集CDH12的肿瘤对ICT表现出更好的效果。在所有情况下，通过对肿瘤CDH12富集进行患者分层比目前膀胱癌亚型能更好的预后预测。CDH12群体类似于一种未分化的状态，具有固有的侵略性生态学，包括化学耐药性可能是通过祖细胞样基因表达和成纤维细胞激活介导的。CDH12富集细胞表达PD-L1和PD-L2以及耗竭T细胞共定位，可能通过CD49a（ITGA1）介导，为ICT在肿瘤中的功效提供一种解释。总之，本研究描述了一个对膀胱癌治疗具有反向应答的癌细胞群。重要的是还为临床标志物的筛选提供了一个令人信服的框架。

研究背景

肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）的分子分型改变了目前关于MIBC发病机制的概念。然而，即使是最近达成共识的分子分类系统也没有为其在临床决策中的应用提供令人信服的证据，特别是缺乏对治疗反应的预测。利用单细胞RNA测序分析MIBC的新兴研究为肿瘤内异质性提供了初步认识。然而，这些研究主要集中于肿瘤微环境，受限于相对较小的队列规模，尚未提供一个更明确的治疗决策途径。在单细胞水平上的MIBC上皮和非上皮细胞的全面分析将有助于将当前的分子亚型解转到它们的组成部分，从而开发出更有效的预后和预测工具。

材料方法

试验材料：25例MIBC患者和4例非膀胱癌对照的尿路上皮组织

试验方法：sn-RNAseq、空间转录组、TCGA数据库bulk数据、免疫组化

研究结果

1、表达CDH12上皮细胞的鉴定

为了实现表征肿瘤内异质性的第一个目标，作者首先基于sn-RNAseq细胞类型比例研究了MIBC肿瘤的总体细胞组成（图1a）。肿瘤由约90%的上皮细胞、5%的免疫细胞、3%的成纤维细胞和2%的内皮细胞组成，这些细胞根据相应的角蛋白、PTPRC、胶原蛋白、PECAM1、VWF等关键标记基因（图1b）。上皮间室无监督聚类识别到了一个KRT13和KRT17差异表达的类群，KRT13、uroplakins（UPK）、KRT6A细胞周期相关基因类群，以及表达CDH12和其他上皮标记物的细胞群（图1d）。KRT13和UPK人群是仅有的两个缺乏来自免疫浸润MIBC的基因标记的人群，这表明在这些人群中富集的肿瘤代表免疫“冷”肿瘤（图1e）。进一步交叉参照传统的尿上皮分化相关标记表明，KRT13和UPK群体代表一个更分化的表型，而CDH12、KRT6A和cycle群体代表一个未分化或去分化的表型（图1f）。如预期一样KRT13和UPK群体表达了一个上皮细胞分化网络（图1g）。基于单细胞调控网络推断和聚类分析，预测CDH12群体表现出多种发育相关转录因子的高活性，包括NANOG、EOMES、PAX1和HOXD9（图1h）。CDH12和循环群体在干-样和神经内分泌基因标签得分也高（图1i）。

 

图1 单细胞核转录组发现CDH12+肿瘤细胞群

 

2、在健康正常的膀胱上皮细胞中可以发现富集CDH12的细胞

上皮细胞的无监督聚类分为基础、过渡和伞部类群（图2a）。有趣的是CDH12群体与后一类典型群体明显不同，而过渡群体的KRT13和KRT17表达水平最高（图2b）。确定了一个始于基础细胞的轨迹，随后分化为两种途径：一种贯穿CDH12群体，一种跳过CDH12群体（图2c和d）。关键的尿上皮分化标记物沿着这条路径跟踪，在起始阶段CD44高表达，随后中间是KRT13和KRT17，终点站为UPK1A、GATA3、PPARG（图2e）。所有4个正常样本的拟时序分析显示出相似的路径，CDH12群位于起始点附近（图2f）。为了确定CDH12肿瘤细胞与正常肿瘤细胞之间的转录相似性，并推断它们在正常上皮细胞分化轨迹上的位置，作者使用表达相似性，确定了每个MIBC上皮细胞中最接近的正常细胞，然后给肿瘤细胞分配相应的正常潜伏期（图2f）。值得注意的是，最未分化表型对应的间隔得分预测了较差的疾病特异性生存（DSS），而最分化表型对应的间隔得分预测了较好的DSS，中间的间隔得分显示了相反结果之间的过渡（图2f）。

图2 CDH12+肿瘤群体类似于早期未分化尿路上皮细胞的特征并与较差的临床结果相关

 

3、CDH12评分预测MIBC患者不良预后

       作者对TCGA每个肿瘤建立了细胞图谱，并在MIBC或TCGA 2017分类共识背景下进行了分析（图3a）。有趣的是，由于其独特的性质，CDH12特征分布于Ba/Sq、腔内浸润和神经内分泌样亚型，而明显不存在腔内乳头状和腔内不确定亚型（图3a）。这与之前的观察一致，即CDH12群体可能在某种程度上存在于多个先前建立的亚型中（图1e）。CDH12和巨噬细胞信号是不良DSS的唯一预测因子（图3b）。

图3 高CDH12评分预测化学耐药性和成纤维细胞活化

 

4、CDH12评分预测对新辅助化疗的不良反应

       作者观察到低CDH12评分的样本在化疗后倾向于成为高CDH12评分的样本，而高CDH12评分的样本在化疗后倾向于保持高CDH12评分（图3c）。肿瘤开始时CD8T评分较低，化疗后CD8T评分增加，提示免疫激活。

5、CDH12细胞具有耐化疗性并能激活基质

        有趣的是，在化疗反应中，CDH12评分较低的肿瘤细胞凋亡和免疫激活相关基因表达增加，而CDH12评分较低的肿瘤细胞表达增加CDH12评分通过纤维母细胞和内皮细胞活化对化疗有反应（图3d）。作者观察到CDH12群体与成纤维细胞之间有许多显著富集的相互作用，其中最显著的是TGFBR1，CD44和一些整合素，因为它们参与了癌症相关成纤维细胞（CAF）的激活（图3e）。

6、CDH12评分预测化疗后免疫治疗反应

          通过免疫激活，作者发现低CDH12评分的肿瘤化疗后PDCD1LG2（PDL2）表达增加，而在所有样本中，PDL2表达高于PDL1（CD274）表达（图4a）。之前的观察与单细胞核转录组数据一致，显示CDH12细胞在上皮细胞中表达了最高水平的PDL2（图4b）。化疗后的样本中，CDH12水平预示着更好的OS（图4c）。此外，只有在化疗后，CD8T评分和PDL1和PDL2的表达显示了显著的预后价值（图4c）。CDH12评分也与化疗后的病理反应相关，事实上，它是与化疗后反应显著相关的唯一因素，甚至考虑到已建立的一致MIBC亚型（图4d和e）。

图4化疗后CDH12评分预测免疫检查点治疗的良好反应

7、CDH12细胞通过CD49a和CD8 T细胞相互作用

        虽然作者再次发现CDH12上皮细胞和T细胞之间有许多显著的相互作用，但作者发现最强的相互作用是在CD8 T细胞上编码CD49a的ITGA1（图4f）。在有针对性的检查点交互分析中，作者发现CDH12群体与CD8T细胞具有最强的PDL2-PD1和CTLA-4互作，而KRT13和UPK群体通过TIGIT和TIM-3与CD8T细胞互作（图4g）。

8、CDH12细胞与CD8 T细胞共定位

为了验证CDH12上皮细胞引起T细胞假说，作者使用Visium空间转录组和单细胞核转录组研究肿瘤中基因表达定位。CDH12富集的区域也富集了CD8T细胞marker和ITGA1（图5a）。为了验证CDH12上皮细胞在单细胞水平上与T细胞共定位，作者设计并使用CODEX平台对同一肿瘤队列的肿瘤组织微阵列进行了35位免疫组化检测（图5b）。

图5 CDH12肿瘤细胞优先与表达CD49a、PD-1和LAG3的T细胞共定位

 

9、CDH12细胞用耗竭的CD8 T细胞定义细胞生态位

         与Visium空间转录组学结果一致，作者再次使用k近邻法观察到CD8T与CDH12上皮细胞比KRT13上皮细胞更接近（图5c）。相比之下，作者鉴定了2个KRT13上皮细胞富集CD8T细胞未富集的CNs（图5d）。此外，根据shannon指数评发现CDH12富集的CNs在其组成的细胞类型上比KRT13富集的CNs更具多样化（图5e）。

        CDT8细胞存在的CDH12富集的CNs相比于非CDH12富集的CNs，CD49a、PD-1和LAG3高表达（图5f和g）。相反，左侧表达PD-L2水平较低；三个相关的CNs中，CN14含有PD-L1和PD-L2表达最高的CDH12细胞这与LAG3表达最高的CD8T细胞一致，促进CD8T细胞的耐受性状和PD-1的衰竭（图5f和h）。

研究结论

        总之，作者第一次进行了MIBC单细胞核转录组阐明当前分子亚型的组成，并获得更高分辨率的具有治疗相关性的分子标记。作者获得了与特定细胞群、尿上皮分化和瘤内空间邻近相关的标记基因，这些标记基因提供了比先前基于bulk亚型更优的治疗相关性（图6a）。通过这些发现作者推测基因表达谱可以帮助患者分类是否受益于NAC（图6b）。NAC后肿瘤低C3评分可能受益于靶向替代免疫检查点途径如TIM3或TIGIT，而高表达的肿瘤可能受益于单药或联合ICT（图6b）。还为一些基于NAC前C3的评分高的肿瘤患者以及NAC后残留疾病患者临床试验提供了令人信服的理由（图6b）。