分类： 转录组测序
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MADS-box转录因子决定了密切相关的常绿和蝴蝶花属植物冬季越冬休眠的持续时间

英文标题：MADS-box transcription factors determine the duration of temporary winter dormancy in closely related evergreen and deciduous Iris spp.

发表杂志：JournalofExperimentalBotany

影响因子：7.86

发表单位：浙江大学

原文链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34752617

研究背景

冬季休眠是植物应对潜在致命环境的最关键策略。近几十年来，由于气候的变化，在经济上具有重要意义的多年生双子叶植物中的这一过程得到了广泛的研究。然而，在不需要冷却的常绿单子叶植物中，休眠过程至今仍是一个谜。因此，揭示这些单子叶植物越冬休眠的调控机制，不仅有助于更好地开发利用植物资源，而且对应对全球变暖带来的低温不足的挑战具有重要意义。通过多年物候观测发现，鸢尾和蝴蝶花越冬休眠过程均仅有生态休眠，将休眠植株移至适宜条件下能迅速恢复生长，且在同一栽培地区二者越冬休眠期存在明显差异，是研究多年生单子叶植物越冬休眠机理的理想材料。本研究比较了鸢尾(I.tectorum)和蝴蝶花(I.japonica)在关键发育时间点的休眠过程。这两种鸢尾都表现出短暂的休眠过程，且持续时间不同，在温暖条件下都能很容易地恢复生长。为了破译转录变化，作者对鸢尾进行了全长测序，对蝴蝶花进行了RNA-seq测序，分别生成参考转录组，揭示了调控常绿与落叶类鸢尾越冬休眠的分子机制。

材料

两种鸢尾属植物1年生大小一致的根茎。每两周采集根梢样品(包括根梢和3片幼嫩叶片)，立即用液氮冷冻，80℃保存待分析.

方法

鸢尾（IT）：从每个根尖茎样品中提取的总RNA等混合构建一个文库，利用PacBio平台进行测序。并将5个关键发育阶段，即秋季生长(FG)、休眠诱导(DI)、休眠(D)、休眠解除(DR)和春季生长(SG)的样本使用Illumina进行RNA-seq测序，并设置三个生物重复。

蝴蝶花（IJ）：利用Illumina平台对FG、DI、D、DR、SG阶段的样本进行测序，并进行从头组装，为蝴蝶花生成参考转录组。

结果

一、鸢尾的季节性生长-休眠周期和休眠状态的确定

作者首先追踪了鸢尾的季节性生长-休眠周期，发现其在休眠期间的形态变化不同于多年生双子叶植物。通过一项大规模的野外实验，将常绿鸢尾和落叶鸢尾植物暴露在不同的生长-休眠状态下。两种鸢尾均表现出相似但不同的生长-休眠动态。后续对采集的样品进行再生长试验以验证其休眠状态，两种鸢尾均经历了短暂的休眠。值得注意的是，在同一阶段，IJ相对于IT感知到更低水平的休眠诱导刺激。

二、转录组数据差异分析及功能鉴定

IT参考转录组由短读RNA-Seq获得，由83,351个转录本组成。IJ的FL参考转录组由58,654个平均长度为2,411bp的非冗余转录本组成。PCC对每个物种的所有转录本进行分析，验证了在每个阶段收集的生物重复的一致性，不同日期的样本处于不同的生长-休眠阶段。在IJ和IT分别鉴定出15118个和10176个差异转录本。为了确定不同生长-休眠阶段之间的转录变化，作者比较了每个鸢尾物种在相邻阶段的转录本表达，在IJ中生长-休眠转变比休眠-生长转变引起更复杂的转录变化，而在IT中正好相反。这些表达差异与物种间的形态差异一致。转录因子预测显示LOB、MADSMIKC和NF-YC转录因子家族在IJ中差异比率最高。为了更深入地了解物种间差异转录本的功能差异，我们对每个比较中上调或下调的差异转录本进行KEGG富集分析。各鸢尾物种在D期前后，代谢途径相对丰富，尤其是碳水化合物相关的代谢途径，并且对差异表达变化明显的基因进行PCR验证。

三、共表达网络揭示了越冬性休眠特有的基因模块

为了了解基因和通路的动态变化，并识别鸢尾越冬性休眠过程中的休眠相关模块，我们对IJ的所有15118个差异转录本进行了WGCNA分析，共鉴定出12个共表达模块.对每个模块进行了主要的表达趋势和KEGG富集分析。并进行模块-形状关联分析，选择形状特异性模块和阶段特异性模块。结果中找到分别与冬季生长率呈显著正、负相关的生长模块（red）和休眠模块（brown），MADS-box家族基因FUL/AP1和SVP分别位于两个模块，并与植物激素合成与信号转导、碳水化合物代谢和环境响应通路基因共表达。

四、差异转录本的表达及与植物激素相关的生理特性

为了进一步解剖鸢尾越冬休眠所必需的基因和通路，我们对基因表达谱和相关生理特征进行了更详细的研究。结果表明，脱落酸水平在D期升高了两倍以上，并与SER呈显著负相关，表明脱落酸在鸢尾越冬休眠中的保守作用。脱落酸生物合成和分解代谢的稳态jing q调控植物中的脱落酸水平。相比之下，IJ中参与脱落酸生物合成的差异转录本在DI过程中保持较低的表达水平。因此，作者推断IJ中脱落酸水平的降低比IT中保证了更长的营养生长周期。推测这可能是由于脱落酸生物合成的抑制和分解代谢的活跃所致。

与脱落酸不同的是，在之前的休眠研究中很少关注茉莉酸。然而，茉莉酸与脱落酸协同相互作用，阻止植物生长，并调节防御过程。相比之下，两种虹膜物种的茉莉酸水平与SER呈正相关，并与生长相关的MERed呈显著正相关，表明茉莉酸可能促进鸢尾越冬性休眠期间的生长。因此，茉莉酸生物合成基因LOX的强烈上调可能有助于两种鸢尾在DR阶段茉莉酸的快速积累。此外，在两个物种中茉莉酸/脱落酸和SER均呈正相关，表明茉莉酸和脱落酸可能在鸢尾越冬性休眠过程中起拮抗作用。在本研究中，编码茉莉酸的差异转录本在两种鸢尾中均表现出不同的表达模式，这可能导致了不同的休眠时间。它们不同的串扰模式可能与虹膜越冬性休眠的形成有关，因为脱落酸和茉莉酸可以协调作用常绿和落叶鸢尾的营养生长和应激反馈。

五、差异转录本在碳水化合物代谢和蔗糖和淀粉含量中的表达

蔗糖是从光合源器官(如叶片)到贮藏组织的初级糖。当植物处于旺盛状态时，蔗糖转化为淀粉的转化率很高。相反，淀粉降解途径主要通过积累可溶性糖来降低细胞渗透压，同时释放内休眠和构建生态休眠。因此，处于生态休眠状态的植物在休眠器官中积累了较高的糖含量，并且在休眠植物中糖含量更高。与此相一致，IJ中蔗糖含量较低可能导致休眠持续时间相对于IT较短。此外，正如之前所观察到的，IJ中较低的淀粉积累在一定程度上证实了其较低的生态休眠特征。此外，蔗糖含量可能作为信号分子影响脱落酸敏感性，从而抑制生长。与此相一致的是，脱落酸相关基因与IJ淀粉合成模块中的基因共表达。综上所述，IJ中活性淀粉的生物合成和活性淀粉的降解程度较高，导致蔗糖含量较低的时间较长，这可能与休眠时间比IT短有关。

六、差异转录本与ROS清除中的生理生化变化

ROS积累被认为是触发生态气味的重要信号机制，并与休眠时间呈负相关。与此同时，激活抗氧化防御和解毒途径以去除ROS。在本研究中，差异转录本从DI到DR，与IJ相比，IT脯氨酸积累更多，SOD活性更高，表明IT中ROS清除能力更强。同样，编码GST的差异转录本上调的时间更早，这可能导致休眠进入IT的时间较早。综上所述，这些指标的变化使IT比IJ表现出更强的氧化应激反应。因此，相对于IT，IJ中脯氨酸浓度较低，SOD活性较低，GST基因表达随后升高，表明IJ中休眠时感知的ROS应激水平较低，这可能导致其休眠时间较短。

七、休眠过程中MIKCCMADS-box基因的系统发育分析及表达模式

MIKCCMADS-box基因编码在植物生长发育中发挥关键作用的转录因子，这些转录因子在真核生物中高度保守。为了研究鸢尾MIKCCMADS-box蛋白之间的系统发育关系，并对其亚家族进行分类，以具有代表性的植物为样本构建了系统发育树，揭示了其在单、双子叶植物中的保守性，以及FLC和FUL/AP1等在多年生单子叶植物短暂越冬休眠过程中的新功能。

总结

本研究通过全长转录组分析，得到MADS-box家族基因可能在调控鸢尾越冬休眠过程中发挥重要功能，并通过WGCNA共表达分析找到与冬季生长率相关的基因模块，并对上述通路的基因表达和生理生化变化进行分析，发现脱落酸和茉莉酸在协调两种鸢尾越冬生长和胁迫响应中发挥拮抗作用，而碳水化合物代谢和活性氧清除能力的差异可能导致了常绿与落叶鸢尾越冬休眠期长短不同。另外，对两种鸢尾和代表性植物MIKCCMADS-box成员进行进化分析，揭示了单子叶在临时WD过程中的一些共同特征，以及单子叶中可能存在的新角色，如开花位点C和FUL。综合来看，本项研究结果不仅提供了多年生单子叶植物中越冬休眠的图像，而且也为植物中越冬休眠的调控机制提供了新的见解。

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