中文標(biāo)題:?通過牟氏角毛藻和原生細(xì)菌對(duì)高鹽榨菜廢水進(jìn)行藻類修復(fù)與應(yīng)用

英文標(biāo)題:?Phycoremediation and valorization of hypersaline pickled mustard wastewater via?Chaetoceros muelleri?and indigenous bacteria

期刊名稱：Bioresource Technology

合作單位：重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

影響因子：11.4

研究對(duì)象：高鹽榨菜廢水

研究方法：16s rRNA測(cè)序

百邁客生物在該研究中提供了16s rRNA測(cè)序服務(wù)。

研究背景

榨菜是以芥菜為原料，經(jīng)多級(jí)酸洗、多次鹽溶液浸泡、壓出果皮而制成的腌菜。榨菜生產(chǎn)是中國三峽庫區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)。榨菜生產(chǎn)第一階段產(chǎn)生的廢水占整個(gè)產(chǎn)量的50%以上。第一階段的高鹽榨菜廢水(PMW)具有高鹽、高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(有機(jī)質(zhì)、氨氮和磷)和低pH值的特點(diǎn)。高鹽廢水的直接排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞。目前處理高鹽廢水的方法主要有物理化學(xué)方法，如電滲析膜法和過硫酸鹽活化法，主要用于預(yù)處理階段。雖然這些方法可以有效緩解高鹽度對(duì)微生物的抑制，但這些方法具有成本高、效率低的特點(diǎn)。因此，尋找一種高效、環(huán)保、可持續(xù)的PMW處理方法具有重要意義。

本研究旨在探討硅藻-細(xì)菌聯(lián)合體處理原料PMW的可行性。本研究對(duì)微生物群落的生長(zhǎng)、光合作用、抗氧化酶活性等變化進(jìn)行了全面的研究。此外，還對(duì)硅藻-細(xì)菌聯(lián)合去除營(yíng)養(yǎng)物的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。最后，在半連續(xù)模式下進(jìn)行了室外中試栽培，以驗(yàn)證生物修復(fù)效果。本研究為硅藻-細(xì)菌聯(lián)合體在PMW處理中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

材料方法

采用16s rRNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了PMW、MMW0和MMW12的微生物多樣性。（MMW0 、MMW1 2 ：10 % PMW中的微生物菌團(tuán)，第0天和第12天）

營(yíng)養(yǎng)分析（TN、TP、NH-N等）、抗氧化酶活性（MDA、SOD、CAT）

研究結(jié)果

1.營(yíng)養(yǎng)物去除

PMW中的氮元素主要以NH₄⁺-N的形式存在。如圖1A和1B所示，5% PMW組的聯(lián)合體對(duì)NH₄⁺-N和TN的去除效果最好，其次是10% PMW組。與5% PMW組相比，10% PMW對(duì)TN和NH₄⁺-N的去除率分別下降了2%和4%。與10% PMW相比，20% PMW對(duì)TN和NH₄⁺-N的去除率分別下降了22%和27% (p < 0.05)。

磷主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸和磷脂。隨著PMW濃度的增加，TP的去除率逐漸降低(圖1C)， 5%、10%和20% PMW組的去除率分別達(dá)到99%、96%和79%。其中，5%和10% PMW對(duì)總磷的去除率差異不顯著(p > 0.05)， 20% PMW對(duì)總磷的去除率顯著低于10% PMW 。

不同組硅藻-細(xì)菌聯(lián)合體對(duì)COD的去除效率如圖1D所示。隨著初始COD濃度的增加，聯(lián)合體對(duì)COD的去除率逐漸降低。5% PMW和10% PMW組的COD去除率分別約為76%和82%，而20% PMW組的COD去除率僅為63%。高濃度的NH₄⁺-N(>100 mg/L)可能會(huì)阻礙微藻的生長(zhǎng)，降低其生物修復(fù)活性，是導(dǎo)致COD去除率下降的主要原因。

結(jié)果顯示，經(jīng)過12天的處理，原生微生物在10%的PMW中分別去除了6%、11%、12%和18%的TN、NH₄⁺-N、總磷和COD(圖1)。這表明，雖然PMW中存在的原生細(xì)菌促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除，但硅藻在處理原料PMW中發(fā)揮了主要作用。根據(jù)上述結(jié)果和PMW的排放標(biāo)準(zhǔn)，確定了10%的PMW是通過C. muelleri和細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)PMW進(jìn)行生物修復(fù)的最適宜濃度。

2.光合色素分析、光合效率分析

微藻中的光合色素，如葉綠素a和類胡蘿卜素，通過捕獲光來指導(dǎo)光系統(tǒng)II中的電子傳遞，參與生理代謝的調(diào)節(jié)。不同PMW濃度各組葉綠素a含量變化如圖2A所示。10% PMW的葉綠素a含量最高。5% PMW中葉綠素a含量降低可能與養(yǎng)分不足有關(guān)。在20%的PMW條件下，培養(yǎng)7天后，藻的顏色逐漸變白，說明C. muelleri不能耐受高于20%的PMW培養(yǎng)基。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了10%的PMW是被試組中穆勒梭菌生長(zhǎng)的理想濃度。

Fv/Fm檢測(cè)可以快速評(píng)價(jià)微藻對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性。隨著PMW濃度的增加，在圖2B中，在第12天，10% PMW的Fv/Fm最高(0.658)。與未添加PMW相比，5% PMW、10% PMW和20% PMW的Fv/Fm分別降低了8%、2%和46%。這表明藻類的能量轉(zhuǎn)化率降低，對(duì)微藻的光合作用有一定的抑制作用。在20%的PMW中，F(xiàn)v/Fm值恢復(fù)，表明C. muelleri對(duì)不利環(huán)境產(chǎn)生了特異性抗性。Fv/F0可用于確定植物的光合效率和生理狀態(tài)。Fv/F0的下降(圖2C)表明C. muelleri供體側(cè)的水分裂復(fù)合物崩潰，導(dǎo)致電子傳遞能力下降。有效量子產(chǎn)率(ΦPSII)可以揭示微藻在不同環(huán)境條件下的生理狀態(tài)和PSII的性能。5%、10%和20% PMW組C. muelleri的ΦPSII分別為0.16、0.24和0.06(圖2D)?？傮w而言，10% PMW處理下C. muelleri的光合效率最好，這也有利于PMW處理。

3.抗氧化酶活性

在正常生長(zhǎng)的微藻-細(xì)菌聯(lián)合體中，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和去除的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持機(jī)體功能起著重要作用。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和損傷程度的常用指標(biāo)，是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一。抗氧化酶活性的變化如圖3所示。在第12天5%、10%和20% PMW組SOD活性分別為為2.06、2.34和2.73 U/mgprot。CAT活性表現(xiàn)出與SOD活性相似的趨勢(shì)。與SOD類似，CAT也是存在于大多數(shù)生物體中的一種抗氧化酶。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性升高20%，表明PMW組抗氧化酶活性升高。5%、10%和20% PMW中MDA含量分別為1.74、1.76和2.04 nmol/mgprot(圖3)。MDA含量的持續(xù)增加表明高濃度PMW對(duì)微藻細(xì)胞造成了損傷。來自聯(lián)合體的抗氧化酶活性增加，以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激造成的損害

隨著PMW濃度的增加，微藻-細(xì)菌聯(lián)合體分泌的ROS和MDA也逐漸增加。這再次證明，與5%和20%的PMW相比，10%的PMW是廢水處理和C. muelleri培養(yǎng)的最佳初始濃度。

4.胞外聚合物分析

菌藻共生系統(tǒng)的EPS是硅藻-細(xì)菌聯(lián)合體在一定環(huán)境條件下分泌的聚合物，主要由蛋白質(zhì)和多糖組成。圖4顯示了松散結(jié)合EPS (LB-EPS)和緊密結(jié)合EPS (TB-EPS)蛋白和多糖含量的變化。試驗(yàn)前2 d EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量呈上升趨勢(shì)。隨著處理的進(jìn)行，LB-EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)波動(dòng)(圖4A和4B)，而TB-EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量在整個(gè)培養(yǎng)過程中保持增加的趨勢(shì)(圖4C和4D)。這表明硅藻-細(xì)菌聯(lián)合體分泌的LB-EPS和TB-EPS在長(zhǎng)時(shí)間暴露于PMW下的反應(yīng)是不同的。

在整個(gè)培養(yǎng)過程中，EPS各組分的蛋白質(zhì)含量始終低于多糖含量。TB-EPS的蛋白多糖比(PN/PS比)會(huì)影響EPS的疏水性或粘度。TB-EPS的PN/PS比值從第0天的0.47下降到第6天的0.39、0.34和0.31，分別為5%、10%和20% PMW組。處理結(jié)束時(shí)，20% PMW組的PN/PS比顯著高于5%和10% PMW組(p < 0.05)。PN/PS比值的降低表明PMW不適合C. muelleri等細(xì)菌的聚集。20% PMW組蛋白質(zhì)和多糖總濃度高于5%和10%組。這進(jìn)一步證明，20% PMW組微藻-細(xì)菌聯(lián)合體受到較高的應(yīng)激時(shí)，其分泌的EPS更多。

5.微生物群落的組成

與PMW組和MMW0組相比，MMW12組的OTUs分別降低了13%和31%。這表明PMW中局部細(xì)菌與微藻的相互作用導(dǎo)致了物種總數(shù)的減少。這可能是由于微藻產(chǎn)生的有機(jī)物降低了細(xì)菌的活性，導(dǎo)致細(xì)菌豐度下降。Chao1和ACE的模式與OUTs相似，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。Simpson指數(shù)可以用來估計(jì)樣品中細(xì)菌的多樣性，Simpson值越小，群落的多樣性越豐富。細(xì)菌多樣性最高的是MMW0組，其次是PMW組和MMW12組。由此可以推斷，接種C. muelleri降低了PMW中微生物種類的多樣性。

為了進(jìn)一步明確細(xì)菌在系統(tǒng)中的作用，在門和屬水平上的10個(gè)優(yōu)勢(shì)分類群如圖5A和5B所示。Proteobacteria豐度在PMW中達(dá)到58%，與C. muelleri在MMW12共培養(yǎng)條件下增加到77%。變形桿菌中含有多種促進(jìn)氮轉(zhuǎn)化和有機(jī)物降解的功能菌株。此外，與PMW相比，MMW12組放線菌和藍(lán)藻菌的豐度也有所增加。

在屬水平上，PMW中最占優(yōu)勢(shì)的分類群是Halomonas、Malaciobacter和Marinobacter。MMW12培養(yǎng)體系中Marinobacter的豐度最高。Marinobacter是一種反硝化微生物，可以耐受高鹽環(huán)境，促進(jìn)PMW中NO3—N轉(zhuǎn)化為N2排放而不產(chǎn)生N2O。在PMW中，Malaciobacter的豐度為10%，這可能是由于長(zhǎng)期儲(chǔ)存所致。MMW12體系中Malaciobacter的豐度降至0.024%，說明微藻對(duì)病原菌有一定的抑制作用。與PMW相比，PMW中Bradymonadale的豐度從1%增加到8%，而MMW12中Bacteroides的豐度明顯下降。這可能是由于Bradymonadales可以以各種細(xì)菌為食，并對(duì)Bacteroides表現(xiàn)出高度偏好。據(jù)報(bào)道，Hoeflea能促進(jìn)氮轉(zhuǎn)化和有機(jī)物降解。因此，MMW12中Hoeflea豐度的增加可能有利于C. muelleri對(duì)養(yǎng)分的利用。C. muelleri增加了有機(jī)物降解菌和氮轉(zhuǎn)化菌的相對(duì)豐度。這些細(xì)菌可以將大分子有機(jī)物降解成容易被C. muelleri利用的物質(zhì)。

研究總結(jié)

在本研究中，通過C. muelleri和原生細(xì)菌的共同處理，成功地實(shí)現(xiàn)了高鹽PMW的生物修復(fù)。在12 d內(nèi)，COD、TN、NH₄⁺-N和總磷的去除率分別達(dá)到82%、94%、90%和96%。高濃度的PMW可以增加ROS和MDA的分泌，從而抵抗應(yīng)激環(huán)境。在MMW12中，Halomonas和Marinobacter的相對(duì)豐度顯著增加。同時(shí)，C. muelleri可以降低MMW12中潛在致病性Malaciobacter的相對(duì)豐度。中試規(guī)模驗(yàn)證也為通過微藻生物技術(shù)處理PMW的實(shí)際應(yīng)用提供了參考。