2025年3月，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所蘭培祥教授、陳知水教授和肝臟外科程琪教授研究團隊在Journal of Hepatology發(fā)表題為”Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury”的研究論文。研究使用單細胞轉錄組測序技術等多種技術，深入闡述人鼠中減輕肝缺血再灌注損傷的腦-肝軸調控通路，發(fā)現酸味刺激竟然可以通過神經信號緩解肝臟損傷！這一發(fā)現不僅為肝臟疾病的治療提供了新思路，還從現代科學的角度驗證了中醫(yī)“酸入肝”的理論。
文章標題：Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury
期刊名稱：Journal of Hepatology
影響因子：26.7
合作單位：華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院
百邁客生物為該研究提供了10X單細胞轉錄組測序技術服務。
研究背景
在中醫(yī)理論中，酸味與肝臟有著密切的關系。中醫(yī)經典《黃帝內經》中提到“酸入肝”，認為酸味食物能夠滋養(yǎng)肝臟，調和氣血，促進肝臟的生理功能。像檸檬、山楂、醋等酸味食物，常被用來調理肝氣郁結、疏肝解郁。這次的研究，不僅讓中醫(yī)的古老智慧得到了科學驗證，還為酸味在肝臟疾病治療中的應用提供了新的依據。
肝損傷是多種肝病常見的病理生理基礎，與炎癥有關。肝缺血再灌注損傷是一種局部無菌炎癥響應，主要由先天免疫細胞驅動，是肝切除術中早期器官功能障礙和衰竭的重要原因。傳統(tǒng)認為肝缺血再灌注引起的炎癥是由肝和死亡細胞釋放的DAMP（損傷相關分子蛋白）被肝駐留庫普夫細胞、單核細胞、單核-巨噬細胞等識別，釋放趨化因子和促炎癥因子，招募循環(huán)白細胞促使炎癥發(fā)生。此外，近年來，神經免疫調控成為研究熱點，科學家們發(fā)現，神經系統(tǒng)可以通過釋放神經遞質、神經肽等分子來調節(jié)免疫反應。然而，如何通過神經信號來治療肝臟炎癥，仍然是一個未解之謎。
材料及方法
研究方法：單細胞核轉錄組測序（n=3，肝及腹腔神經節(jié)），組織學染色，熒光染色，病毒示蹤，免疫印記，免疫沉淀串聯質譜，bulk RNA-seq，qRT-PCR，流式細胞術等。
研究材料：C57BL/6J小鼠缺血再灌注損傷模型，Fam19a2-/-Ccr2-/-小鼠，小鼠海馬神經元細胞系HT122。
研究結果
1.酸刺激減輕肝缺血再灌注損傷
研究者首先構建酸刺激下肝臟缺血再灌注損傷（IRI）小鼠模型，發(fā)現酸刺激可以減少肝組織損傷以及血清標志物水平。但是，使用丁卡因局麻小鼠舌頭或者灌胃檸檬酸不能減少肝損傷和血清標志物水平；NMDAR阻斷劑1（阻斷NMDAR介導的興奮性突觸傳遞）立體定位注射到腹后內側核（VPN）后，酸刺激后IRI肝的血清標志物水平和肝損傷程度無明顯變化，表明神經系統(tǒng)在酸刺激減輕IRI過程中起重要作用。此外，小鼠VPN注射示蹤病毒的實驗結果顯示，肝臟以及CG（腹腔神經節(jié)）均檢測到熒光，行腹腔神經節(jié)切除術能降低IRI肝的組織損傷和血清標志物水平，表明酸刺激減輕肝損傷過程通過腦-CG-肝軸。
圖1-酸通過神經減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷
圖2-腦和肝中分布的H129感染神經
2.酸刺激通過減少TAFA2產生降低肝IRI
對肝IRI小鼠、酸刺激后肝IRI小鼠及sham（假手術）小鼠的肝臟和CG進行單細胞核轉錄組測序，結果顯示IRI引起肝細胞和神經元基因表達譜發(fā)生變化，IRI肝中免疫細胞數量增加，但酸刺激后IRI樣本中免疫細胞數量減少。神經元較為特異性地表達TAFA2，IRI可引起肝神經元TAFA2表達水平增加，但酸刺激使得TAFA2表達水平降到與sham對照組相近水平。實驗發(fā)現鉀離子可引起小鼠海馬神經元細胞系HT22顯著高表達TAFA2，使用鉀離子通道抑制劑可減輕肝損傷，支持酸刺激通過神經系統(tǒng)減輕肝損傷的假設。進一步的，使用慢病毒敲低神經元TAFA2表達水平或使用TAFA2敲基因鼠，發(fā)現IRI引起的肝組織損傷、巨噬細胞浸潤以及血清標志物水平降低，表明TAFA2在肝IRI中有著重要作用。
圖3-酸刺激減少小鼠IRI肝中神經細胞Fam19a2表達水平
圖4-Fam19a2敲除或敲低，使得小鼠肝臟缺血再灌注損傷降低
?3.IRI肝中TAFA2與巨噬細胞相互作用
體外實驗發(fā)現TAFA2不引起肝細胞凋亡；snRNA-seq數據顯示IRI肝中巨噬細胞比例增加且炎癥相關基因表達水平增加，但在酸刺激組中降低；流式細胞術實驗結果表明，TAFA2與巨噬細胞結合而不與T/B細胞結合，不論是否酸刺激T/B細胞比例無顯著變化，IRI肝中CD11b+F4/80low?巨噬細胞增加而酸刺激可降低該巨噬細胞數量；TAFA2敲除或敲低抑制IRI肝中巨噬細胞的浸潤，這些結果表明TAFA2促進巨噬細胞活化。體外實驗結果表明，TAFA2可以激活BMDM（骨髓來源巨噬細胞），引起Il1α，Il1β，Il6和Tnfα的表達，這些結果表明TAFA2激活的巨噬細胞介導了肝IRI。
圖5-TAFA2使得IRI中巨噬細胞比例增加，刺激炎性細胞因子的產生
4.TAFA2通過CCR2與巨噬細胞互作
體外實驗表明巨噬細胞上的CCR2是TAFA2受體，CCR2敲除小鼠IRI肝的組織損傷以及巨噬細胞浸潤降低，血清標志物水平降低。TAFA2或CCL2刺激后BMDM的bulk RNA-seq數據表現出幾乎一致的轉錄組表達譜，粘附、代謝、Ras信號通路相關差異基因表達上調，代謝和核糖體通路相關基因表達下調，TAFA2誘導BMDM更高的表達Il1α，Il1β，Il6，Tnfα以及干擾素相關基因，促進巨噬細胞介導的炎癥響應。進一步實驗表明TAFA2促使巨噬細胞介導的炎癥響應主要依賴CCR2，但巨噬細胞上也可能存在其他的TAFA2受體。
圖6-TAFA2與巨噬細胞表面CCR2互作
5.酸刺激減輕人類肝切除術中肝IRI
為了確認酸刺激在人類肝IRI中的作用，研究者進行了開放、隨機、空白對照臨床試驗（ChiCTR2400088096），包含多種良性/惡性肝腫瘤、肝外傷、膿腫、囊腫和包蟲病，由于手術期間門靜脈短暫阻斷以減少肝切除過程中出血，導致肝出現缺血再灌注損傷。干預組33名患者，術前24h開始，每8h給與新鮮的25mM檸檬酸（持續(xù)5min），對照組33名患者不接受酸刺激，剔除6名術中肝缺血超過30min患者以及4名依從性差患者，肝切除術后第1/3/5天對患者肝功能進行評估，結果顯示酸刺激組血清ALT和AST水平顯著低于對照組，高ALT水平（>500 U/L）患者數量也顯著更低，這些結果表明酸刺激可減輕人類肝切除術引起的肝IRI。
圖7-酸刺激減輕人類肝切除術中肝IRI
研究總結
該研究首次揭示了腦-肝軸在肝臟IRI中的調控作用，闡明了酸味刺激通過神經信號通路緩解肝臟損傷的機制。研究不僅為肝臟IRI的治療提供了新的思路，還為神經免疫調控在其他器官炎癥中的應用奠定了基礎。研究團隊表示，未來將進一步探索神經刺激療法在肝臟疾病中的應用，特別是通過調控腦-肝軸來緩解肝臟炎癥和損傷。此外，研究團隊還將深入研究TAFA2蛋白的作用機制，開發(fā)針對TAFA2-CCR2信號通路的靶向藥物，為肝臟疾病的治療提供更多選擇。
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- 發(fā)表期刊：Cancer Cell
- 影響因子：48.8
- 發(fā)表日期：2025-2-6
- 發(fā)表單位：中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院
- 課題切入點：本文研究了三陰性乳腺癌（TNBC）中不同治療方案對腫瘤免疫微環(huán)境（TME）的影響，特別是探討了化療與程序性死亡配體1（PD-L1）阻斷聯合療法的細胞機制。
- 研究?材料?：研究從44名TNBC患者中獲取了78份腫瘤活檢樣本，包括接受nab-紫杉醇（Nab-PTX）聯合阿替利珠單抗（ATZ）、Nab-PTX單藥、紫杉醇（PTX）聯合ATZ以及PTX單藥治療的患者。
- 研究方法?：采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和T細胞受體測序（TCR-seq）技術，對TNBC中的免疫細胞浸潤進行了詳細分析。此外，還利用小鼠4T1乳腺癌模型進行了體內驗證實驗，包括RNA測序和流式細胞術分析。?·?研究結論?：研究發(fā)現，不同治療方案下，TNBC中的免疫細胞組成發(fā)生顯著變化。Nab-PTX聯合ATZ治療顯著減少了耗竭性CD8+T細胞（Tex）的比例，同時增加了具有干細胞樣特征的中央記憶T細胞（Tcm）和效應記憶T細胞（Tem）的比例。B細胞亞群，特別是濾泡B細胞（Bfoc），在Nab-PTX聯合ATZ治療的響應者中顯著富集，且B細胞水平與有利反應相關。此外，研究還揭示了不同DC亞群之間的轉化關系，以及它們與T細胞反應之間的相互作用。肥大細胞在Nab-PTX相關治療中顯示出增加的趨勢，且其浸潤水平與有利反應相關。體內實驗進一步證實了肥大細胞激活可以增強抗腫瘤免疫反應，從而提高PD-L1阻斷療法的有效性。
這些發(fā)現不僅增進了我們對TNBC中免疫細胞動態(tài)及其與治療反應之間關系的理解，還為開發(fā)新的化療免疫聯合療法提供了潛在的治療靶點。
- 發(fā)表期刊：Annals of Oncology
- 影響因子：56.7
- 發(fā)表日期：2025-2-4
- 發(fā)表單位：英國倫敦癌癥研究所和英國倫敦皇家馬斯登醫(yī)院
- 課題切入點：該研究探討了基于全基因組測序（WGS）的超靈敏循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測技術在早期乳腺癌分子殘留病灶（MRD）監(jiān)測和復發(fā)預測中的應用?！?研究樣本：研究團隊分析了78例早期乳腺癌患者（包括23例三陰性乳腺癌、35例HER2陽性、18例HR陽性及2例未知亞型）的617份血漿樣本，覆蓋診斷前、新輔助化療期間、術后及長期隨訪（中位隨訪76個月）多個時間點。患者血漿樣本來自英國多家醫(yī)療中心，包括診斷前、新輔助化療周期、術后及定期隨訪樣本。
- 研究方法：對腫瘤組織進行全基因組測序（中位深度38×），篩選高可信度體細胞變異構建個性化檢測panel。血漿游離DNA（cfDNA）經高通量測序后，通過分子共識算法抑制背景噪聲，計算ctDNA水平。所有樣本通過NeXT Personal MRD平臺進行檢測，該平臺基于腫瘤組織的全基因組測序數據，為每位患者個性化設計檢測panel，追蹤中位數1451個體細胞變異，檢測靈敏度可達百萬分之一（1 PPM）。
- 數據分析：采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風險模型評估ctDNA檢測與臨床結局（復發(fā)無生存期RFS、癌癥特異性生存期CSS）的關聯，并通過時間依賴性模型動態(tài)評估MRD狀態(tài)對預后的影響。
- 研究結果：1. 診斷階段：98%（49/50）的患者在治療前檢測到ctDNA，涵蓋所有亞型（HER2+和TNBC均為100%，HR+為88%）。診斷時ctDNA水平升高與較差的RFS（HR=1.82）和CSS（HR=2.19）顯著相關。2. 術后監(jiān)測：所有復發(fā)患者（11/11）在臨床復發(fā)前均檢測到ctDNA（中位提前15個月），未檢測到ctDNA的患者（64/64）均未復發(fā)。術后ctDNA陽性與RFS和CSS顯著惡化相關（均P<0.0001）。3. 靈敏度優(yōu)勢：39%的ctDNA陽性樣本處于超低水平（<100 PPM）。與全外顯子測序（WES）和數字PCR（dPCR）相比，WGS方法在匹配樣本中檢測率更高（WGS 100% vs. WES 84% vs. dPCR 76%）。4. 動態(tài)預后：術后6周或6個月未檢測到ctDNA的患者預后顯著改善。此外，術后早期ctDNA清除（如輔助治療后）可能提示疾病控制良好。
- 研究結論：WGS驅動的超靈敏ctDNA檢測技術顯著提升了早期乳腺癌MRD監(jiān)測的敏感性和特異性，可提前預測復發(fā)并指導臨床決策。其高陰性預測值（NPV 100%）支持在低風險患者中探索治療降階梯策略，而陽性結果則為早期干預提供了依據。未來需擴大樣本量并開展前瞻性研究以驗證其臨床實用性。
Ps：關注醫(yī)學領域腫瘤研究請聯系當地業(yè)務經理獲取原文~
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本次為各位老師帶來重慶醫(yī)科大學黃愛龍教授/唐開福教授團隊在nature子刊?Nature Communications?中發(fā)表的題目為“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。該文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影響 RNA 干擾 (RNAi) 和 RNA 剪接途徑，并揭示了這些途徑在 COVID-19 發(fā)病機制中的作用，有助于開發(fā)更有效的 SARS-CoV-2 相關肺炎治療方法。
中文題目：SARS-CoV-2 N蛋白誘導的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下調導致肺炎
英文題目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia
發(fā)表期刊：Nature Communications?
影響因子：14.7
合作單位：重慶醫(yī)科大學
百邁客生物為該研究提供了小RNA測序和ONT全長轉錄組測序服務。
研究背景
2019 冠狀病毒病 （COVID-19） 由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度異質性，且發(fā)病病例分布在各個年齡群體中，但重癥及死亡率明顯字老年群體比較集中。DNA 損傷是導致衰老的關鍵因素，也是 COVID-19 發(fā)病機制的驅動因素，蛋白質穩(wěn)態(tài)喪失是衰老的另一個標志，會導致不受抑制的炎性小體激活、功能失調的細胞器積累和細胞損傷，可能導致 COVID-19 的發(fā)病機制。Dicer 是 RNA 干擾 （RNAi） 通路的關鍵組成部分，在衰老過程中下調， RNAi 組分的敲除會導致 DNA 損傷，并且可能由于 miRNA的整體下調而增加蛋白質合成，從而影響蛋白質穩(wěn)態(tài)，與年齡相關的剪接因子失調發(fā)生在不同生物體的多個組織中，并且與基因組穩(wěn)定性和蛋白質穩(wěn)態(tài)有關，可通過R環(huán)誘導 DNA 損傷。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 發(fā)病機制中的確切作用還有待明確。
材料和方法
材料：異位表達 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細胞系 ，N 蛋白誘導的雄性肺損傷小鼠及正常對照 C57BL/6J 雄性小鼠；
方法：小RNA測序+ONT全長轉錄組+免疫組化+RIP等
研究結果
1.SARS-CoV-2核衣殼 （N） 蛋白誘導自噬降解及DNA損傷的作用機制
通過對已發(fā)表的COVID-19 患者RNA測序數據的分析，確定了重癥 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于無癥狀 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺組織中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的個體，表明RNAi 成分和剪接因子的表達減少與 COVID-19 感染加重有關。
細胞沉默逆轉測定使用含有內含子的熒光素酶報告基因小基因證明了 SARS-CoV-2 抑制了該小基因的剪接。該研究從相互作用數據集的生物通用存儲庫 （BioGRID） 中檢索了 N 蛋白的推定蛋白質相互作用子，并用免疫共沉淀測定證實了異位表達 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細胞系中 N 蛋白與?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之間的相互作用，進一步定量測定結果發(fā)現，SARS-CoV-2 感染導致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下調，但在 mRNA 水平上不下調，而自噬抑制劑氯喹或巴弗洛霉素 A1 治療可緩解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理并無效果，表明?N 蛋白對?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達的影響是自噬依賴性的。
在 BioGRID 數據庫中找到了一種自噬受體蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦顯微鏡分析和免疫共沉淀分析分別證實了 N 蛋白和 p62 之間的相互作用及其共定位，p62 敲低部分緩解了 N 蛋白誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下調；然而，它不會影響不表達 N 蛋白的細胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通過與 N 蛋白的相互作用將 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬細胞中，導致自噬降解。
ATM等的磷酸化、DNA 斷裂積累等病灶形成證明了異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導了 DNA 損傷，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?導致 DNA 損傷，而它們的過表達部分減輕了 N 蛋白誘導的 DNA 損傷，同時異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導了 R 環(huán)積累，進一步誘導DNA損傷，RNase H1（一種降解 R 環(huán)的 RNA 部分的核糖核酸內切酶）的過表達部分減輕了這種影響并減少了 DNA 損傷積累，總的來說，這些發(fā)現表明?N 蛋白誘導的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表達下調導致 DNA 損傷。
2.SARS-CoV-2 N蛋白通過抑制 miRNA 生物發(fā)生及抑制 RNA 剪接作用機制
XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起關鍵作用，小 RNA 深度測序顯示，N 蛋白誘導 miRNA 表達的整體下調，對 A549 和 BEAS-2B 細胞中表達量最高的前五個 miRNA進行定量驗證顯示，它們在表達 N 蛋白的細胞和 SARS-CoV-2 感染的細胞中均下調；生化分級分離實驗顯示，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導 pre-miRNA 的核保留，如細胞核中 pre-miRNA 水平的增加和細胞質中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5過表達后得到緩解。此外，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之間的比率，Dicer過表達后得到緩解?？傮w而言，這些發(fā)現表明，N 蛋白通過降低?XPO5?表達阻斷 pre-miRNA 從細胞核到細胞質的運輸，并通過下調?Dicer?表達抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。
SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有內含子的報告基因小基因的剪接，證實了它們確實是剪接因子，而它們的過表達部分緩解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染對 RNA 剪接的抑制作用，進一步進行全長轉錄組測序，通過可變剪接分析發(fā)現，N 蛋白誘導內含子保留。此外，RT-qPCR證實，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染降低了一組內源性內含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?過表達部分減輕了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 對 RNA 剪接的抑制作用，這些結果表明，N 蛋白通過降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表達來抑制 RNA 剪接。
剪接抑制會誘導廣泛的 IR 和隨后的內含子保留 mRNA 的翻譯，一部分內含子衍生的多肽容易縮合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素對新生多肽進行代謝標記，結果顯示異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導不溶性蛋白合成增加，而N蛋白與RNA的結合主要在可溶性蛋白部分被檢測到，免疫熒光檢測結果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染誘導了 EGFP 聚集體的產生，誘導蛋白毒性應激。
3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影響及動物模型驗證
盡管異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染導致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整體蛋白質合成，而沒有顯著影響 S6K1 磷酸化，對照組的刺突蛋白和膜蛋白對整體蛋白質合成沒有影響，而包膜蛋白甚至抑制了整體蛋白質合成，Dicer?或?XPO5?敲低導致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同時略微增加 S6K1 磷酸化并促進蛋白質合成，表明 N 蛋白通過降低?Dicer?和?XPO5?表達來促進蛋白質合成，并通過下調?SRSF3?和?hnRNPA3?表達來抑制蛋白質合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下調比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下調更顯著地促進蛋白質合成，因此 N 蛋白最終增強了蛋白質合成。
小鼠體內驗證結果顯示， N 蛋白在小鼠肺組織中的表達導致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調、DNA 損傷、胞質 DNA 積累、細胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配體上調，以及伴有明顯巨噬細胞浸潤的肺炎，肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低導致肺損傷和肺炎，而它們的過表達部分緩解了 N 蛋白誘導的肺炎，這些結果表明，N 蛋白誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達下調是 SARS-CoV-2 誘導肺炎的一種機制。
分析已發(fā)表的 3、6、12 和 24 個月齡 C57BL/6J 小鼠肺組織的 RNA 測序數據，在 8 周齡和 18 個月齡 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白質水平上證實了肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡依賴性下調， DNA 損傷、細胞凋亡等功能在老年小鼠中明顯富集，結合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低實驗，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡相關下調與 N 蛋白誘導的肺炎嚴重程度增加有關。
PJ34 是一種（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制劑，免疫沉淀結果表明 PJ34 通過阻止 N 蛋白誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下調來緩解肺炎，阿那曲唑是一種增強 Dicer 表達的芳香化酶抑制劑，WB結果表明，阿那曲唑通過促進?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表達來緩解 SARS-CoV-2 N 蛋白誘導的肺炎。
思路發(fā)散
本研究通過數據庫檢索及分子實驗驗證先初步推測SARS-CoV-2 N蛋白的年齡依賴調控機制與RNAi以及可變剪接相關，之后通過組學測序在整體水平上驗證了猜測并進一步細化了調控方式，之后再通過大量過表達及敲降后對應分子在RNA及蛋白水平的定量驗證了結果，是一個比較經典有效的實驗思路，可以在其他實驗中參考。
參考文獻：
Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.
]]>本期為各位老師帶來一篇關于小RNA及l(fā)ncRNA研究的高分經典案例解讀，希望能為各位老師后續(xù)研究激發(fā)新的研究思路~
中文題目：Klotho衍生肽1通過轉錄后調控恢復Klotho表達抑制纖維化腎臟細胞衰老
英文題目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]
合作單位：南方醫(yī)科大學
發(fā)表期刊：Theranostics?
影響因子：12.4
百邁客生物為該研究提供了miRNA測序服務。
研究背景
慢性腎?。–KD）是一種持續(xù) 3 個月以上的腎功能不全病癥，特征通常是細胞衰老增加、表觀遺傳重編程、持續(xù)的成纖維細胞活化和持續(xù)的細胞外基質（ECM）產生，與老年腎臟存在很多相似之處，因此，CKD現在被認為是一種腎臟過早和加速衰老的狀態(tài)?？顾ダ系鞍?Klotho 屬于由α和β亞型組成的單跨膜蛋白小家族，腎損傷會導致Klotho表達下調，Klotho 缺乏可導致高磷血癥、腎小管細胞衰老和腎纖維化等，進一步加速 CKD的進展，因此Klotho 被認為是腎臟疾病診斷和預后的潛在生物標志物和治療靶點。
然而由于Klotho 是一種大型跨膜蛋白，臨床生產成本高且難度大，因此作者團隊在前期報道了Klotho衍生肽1（KP1） 的發(fā)現，可通過結合TGF-β 受體2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信號轉導來減輕腎纖維化，且生產上會更便捷經濟，有可能替代 Klotho 進行臨床轉化，為了進一步研究 KP1 在保護腎臟中的作用，作者在本篇研究中檢查了其對細胞衰老的影響。
材料方法
材料：8-10周齡雄性C57BL/6小鼠假手術組（sham）、單側缺血再灌注損傷（UIRI）組別小鼠和治療組別小鼠（UIRI + KP1）共三組小鼠腎臟組織；
方法：miRNA測序+雙熒光素酶報告基因檢測+RNA 熒光原位雜交等
研究結果
WB檢測了許多細胞衰老標志物如p21、p16和γ-H2AX的表達，結果表明了UIRI 誘導纖維化腎中對應標志物的表達，而KP1明顯消除了這種誘導。此外針對其內源Klotho 的檢測也證明UIRI 導致腎臟中Klotho 的丟失而KP1在很大程度上恢復了它們的表達，單側輸尿管梗阻（UUO）誘導的 CKD 模型以及體外細胞模型中也出現了類似的結果，此外，UIRI 還導致 Klotho mRNA 的顯著下調。然而，KP1 不影響 Klotho mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平，說明KP1通過獨立于轉錄調控的機制誘導 Klotho。
此外，通過流式細胞術進行的細胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代腎小管細胞停滯在 G1 期，這被 KP1 處理抵消，證明了KP1阻斷細胞衰老的能力，而在可以阻斷新mRNA合成的放線菌素D（ActD）存在下與 TGF-β1 孵育后 12 小時和 24 小時，KP1 不會影響 Klotho mRNA 水平，進一步證實了 KP1 誘導 Klotho 蛋白表達而不影響其mRNA和蛋白質穩(wěn)定性。
由于 KP1 不影響 Klotho mRNA 水平和蛋白質穩(wěn)定性，作者開始探索 KP1 是否通過miRNA調節(jié) Klotho 蛋白，在 UIRI 腎臟中鑒定到了68個上調miRNA，在注射 KP1 后恢復到基線，其中 10 個與 Klotho mRNA 的 3′-UTR 特異性結合，其中miR-223-3p表現非常明顯，且在對公共轉錄組數據集分析后發(fā)現，miR-223-3p 與 Klotho 水平呈負相關，支持了 miR-223-3p 與 Klotho 調節(jié)的相關性。
為了證實 miR-223-3p 在 Klotho 表達中的調節(jié)作用，作者進行了雙熒光素酶報告基因測定，轉染 miR-223-3p 模擬物降低了含有野生型未突變型 Klotho mRNA 序列的報告基因的熒光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特異性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p轉染HK-2細胞進一步證明miR-223-3p抑制 HK-2 細胞中 Klotho 蛋白的表達。體內模型原位雜交驗證了miR-223-3p 在 UIRI 腎腎小管上皮中被誘導，而KP1抑制了miR-223-3p表達，結合免疫熒光染色結果證明了KP1 可以通過在體內抑制 miR-223-3p 來恢復 Klotho 表達，在體外的HK-2 細胞中的miR-223-3p及其拮抗劑轉染實驗也呈現出了相同的結果。
為了進一步驗證實驗結果，作者對小鼠模型靜脈注釋miR-223-3p 表達質粒和 KP1構建體內表達模型，結果顯示，miR-223-3p 的過表達加劇了 p16 、 γ-H2AX 、纖連蛋白、 I 型膠原和 α-SMA 的表達，所有這些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同樣消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纖連蛋白、膠原蛋白 I 和 α-SMA，恢復了腎功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制劑） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制劑） 處理 TGF-β1 刺激的 HK-2 細胞結果進一步闡明了，KP1 通過阻斷 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信號傳導來恢復 Klotho 表達并防止細胞衰老。
由于 miRNAs 和 lncRNAs 經常相互作用并相互調節(jié)，作者搜索了幾個 lncRNA-miRNA 相互作用數據庫，并預測 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （?；撬嵘险{基因 1） 具有推定的結合位點，雙熒光素酶報告基因測定驗證了miR-223-3p 降低了野生型TUG1報告基因的熒光素酶活性，且在 HK-2 細胞中過表達 miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1則消除了這個效果，TGF-β1抑制了HK-2細胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達，而KP1、SB43154或SIS3則消除了此類效果，這些結果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信號傳導的調節(jié)。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但沒有降低其 mRNA 水平，說明miR-223-3p 可以與 lncRNA-TUG1 相互作用，形成競爭性內源性 RNA （ceRNA） 網絡，從而放大其在調節(jié) Klotho 表達和細胞衰老中的作用。體內UUO和UIRI 模型中都驗證了這一點。
綜上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 協(xié)同工作，導致 Klotho 丟失、細胞衰老和腎纖維化，所有這些都被 KP1 緩解。KP1 是一種新發(fā)現的 Klotho 衍生肽，通過恢復 Klotho 表達來抑制細胞衰老，KP1 的這種作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介導的轉錄后調節(jié)運作。通過恢復 Klotho 表達，KP1 充當 Klotho 誘導劑，并具有廣泛的腎保護特性，例如抗氧化、抗衰老和干細胞保護，有望將KP1轉化為 CKD 患者的臨床治療。
思路發(fā)散
本研究中利用miRNA測序、公共lncRNA數據庫以及公共轉錄組數據集共同分析出了miRNA與lncRNA共同構建ceRNA網絡在轉錄后水平調控蛋白表達的作用機制，對于較新的研究來說，可以直接通過全轉錄組，利用同一來源組織構建兩個文庫（lncRNA及小RNA文庫）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的結果，由此可分析出更可靠的相關性調控網絡，便于篩選關鍵非編碼RNA。
參考文獻：
[1] Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future.Cell. 2024 Nov 14;187(23):6451-6485. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.024. PMID:39547208.
[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.
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期刊名稱：cell proliferation.
影響因子：5.9
合作單位：中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院
研究部位：大鼠胚胎
研究方法：空間轉錄組、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測等
百邁客生物為該研究提供了空間轉錄組測序服務。
研究背景
肛門直腸畸形 （ARM） 是兒童常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率為 1/5000。ARM 的病因仍然難以捉摸，其發(fā)病機制與遺傳和環(huán)境因素有關。最近的研究強調了遺傳調控在這一過程中的關鍵作用。ARM 通常發(fā)生在妊娠 4-8 周，主要在出生后診斷，通常需要手術干預作為治療。然而，ARM 患者的長期術后結局并不理想，通常會導致并發(fā)癥，例如大便失禁和慢性便秘。這些并發(fā)癥對受影響兒童的生活質量和社會心理發(fā)展有重大影響。作者的空間轉錄組學分析確定了鐵死亡的發(fā)生，這是一種鐵依賴性的程序性細胞死亡，其特征是活性氧 （ROS） 和脂質過氧化產物在 ARM 后腸內積累。作者假設這個過程受活化 C 激酶受體 1 （Rack1） 的調節(jié)，細胞質蛋白與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白有相似之處。它在細胞生長、分化、信號傳導和免疫反應中發(fā)揮著多種作用，并且在胚胎神經發(fā)育中具有潛在的意義。然而，以前的研究沒有報道 Rack1 在鐵死亡調節(jié)中的作用。因此，它在胚胎消化道發(fā)育和 ARM 形成中的作用需要進一步探索。
材料方法
使用Wistar 大鼠，在 ARM 組中，大鼠在 GD 10開始口服 1% ETU 125 mL/kg，對照組接受等劑量生理鹽水。從 GDs 14-16取胚胎。
1、空間轉錄組測序剖宮產后，立即將取出的胚胎置于冷生理鹽水中以去除表面血。將胚胎以水平矢狀方向放置在含有預冷OCT的包埋盒中儲存在 -80°C 冰箱中。共計6份樣品，切片包括尿道和后腸層。2、免疫熒光
選擇清晰全面顯示尿道、后腸、URS 和尿道回瘺的石蠟切片進行染色。
研究結果
1.空間轉錄組測序的注釋聚類
在這項研究中，作者在 GDs 14-16 （稱為 N14-16） 上使用正常的 Wistar 大鼠胚胎，在 GDs 14-16 （稱為 A14-16） 上使用 ETU 誘導的 ARM 胚胎進行空間轉錄組測序。制備大鼠胚胎的 6 個冷凍中矢狀切片，每個 10 μm 厚。這些切片包括尿道和后腸層，提供了特定時間點泄殖腔發(fā)育的全面視圖（圖 1A）。使用 10× Genomics Visium 空間轉錄組技術，然后進行組織透化、cDNA 合成和文庫構建，作者成功地捕獲了正常和 ARM 胚胎中的視覺基因轉錄數據，主要來自泄殖腔區(qū)域。為了確保來自同一區(qū)域的各種切片樣本之間的可比性和一致性，作者進行了聚類注釋，產生了七個不同的聚類。這些集群包括泄殖腔區(qū)域內的五個特定區(qū)域（集群 0-4），即尿道、后腸、膀胱、URS 和生殖器結節(jié)。此外，兩個簇 （簇 5 和 6） 對應于椎體和神經管區(qū)域 （圖 1A）。平均而言，每個解剖區(qū)域覆蓋 3005 個點，每個點捕獲 16,905 個基因（圖 1B）。
圖1-空間轉錄組測序的注釋聚類
2.正常組和 ARM 組之間的 DEG 篩選
鑒定 DEG 的標準被確定為絕對對數2 倍變化 （|log2FC|） ≥ 0.58 且顯著性水平為 p< 0.05. 這種篩選導致了差異火山圖的創(chuàng)建，以說明基因表達的改變。在 GDs 14、15 和 16 的后腸發(fā)育背景下，作者分別鑒定了 91、439 和 119 個基因，它們在這些時間點表現出不同的表達譜（圖 1C）。值得注意的是，Rack1 （Gnb2l1） 在 GDs 15 和 16 上在 ARM 組后腸內的表達降低。為了進一步探索潛在的分子相互作用，作者進行了全面的 PPI 分析。通過利用 BC 值作為排名標準，作者突出了最顯著的差異表達后腸基因（圖 1D）。樞紐基因，在環(huán)狀排列中用粉紅色節(jié)點表示，包括 Uba52、Rack1 和 Tpt1，在后腸發(fā)育的 GDs 15 和 16 期間，每個基因在基因網絡中都具有顯著的中心性。值得注意的是，Rack1 表現出卓越的連通性，在 GD 15 和 16 的 PPI 網絡中躋身前五名基因之列。
3.在 GD 15 上驗證后腸部分 DEGs
圖 2A-E 全面說明了 GD15 截面泄殖腔區(qū)域中前五個基因的蛋白質表達模式和定位：Rack1、Npm1、Eef1b2、Uba52?和?Tpt1。這些數字是使用免疫熒光染色獲得的。值得注意的是，這 5 種蛋白質在 N15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內均表現出位點特異性表達。除?Tpt1?外，其他 4 種蛋白在 AM 區(qū)域內表現出表達水平升高。此外，觀察到這些蛋白質離散分布在 URS 的下肢和后腸的間質附近。相比之下，這五種蛋白的表達在 A15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內明顯下降，伴隨著尿道直瘺部位的表達水平降低 （p < 0.05）。圖 2F 顯示了平均光密度 （AOD） 的半定量評估，特別是在后腸結構域內。
圖2-在 GD 15 上驗證后腸部分 DEGs
4.PROGENy 算法預測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集
PROGENy 算法用于通過下游基因表達的變化評估信號通路的活性。作者獲得了正常組和 ARM 組 GDs 14-16 樣本中不同通路的活性水平評分。在使用 NNMF 對后腸區(qū)域（N14 因子 16、A14 因子 15、N15 因子 15、A15 因子 20、N16 因子 18 和 A16 因子 10）進行聚類分析中，PROGENy 算法顯示與 MAPK 信號通路呈強正相關，表明 MAPK 信號在后腸中顯著富集（圖 3A)。從這些區(qū)域提取來自 Erk、P38、JNK 和 Erk5 家族的 12 個成員分子的定位表達模式。具體來說，Mapk3 、 Mapk6 和 Mapk14 主要富集在泄殖腔區(qū)域。這些蛋白質的免疫熒光驗證證實了它們在尿道和后腸區(qū)域的特異性表達，在 URS 和間質區(qū)域的表達相對較弱，這與 PROGENy 預測一致（圖 3B）。
圖3-PROGENy 算法預測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集用
5.通過細胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時空表達模式
在基因集富集分析（GSEA）數據庫中，細胞死亡基因集包含161個基因，其中 7 個細胞死亡相關基因是從基因集與GD 15上簇1中的 DEGs 交集中獲得的（圖 4A）。圓形熱圖顯示了與聚類1的6個樣本相同區(qū)域內的細胞死亡基因的表達譜。值得注意的是，發(fā)現谷胱甘肽過氧化物酶家族的關鍵成員?Gpx4?在 GD 15 的簇 1 中下調（p < 0.05；圖 4B）。免疫熒光染色顯示 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮以及 AM 區(qū)域的顯著定位，在 URS 中觀察到的分布相對較淺。在 ARM 組的泄殖腔中觀察到 Gpx4 陽性信號的減少（圖 4C）。AOD 分析表明，在 GDs 15 和 16 上，后腸中 Gpx4 表達在統(tǒng)計學上顯著降低（p < 0.05;圖 4D）。
圖4-通過細胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時空表達模式
6.PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥
N15 胚胎石蠟切片的雙免疫熒光染色顯示 Rack1 和 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮內共定位。該結果表明 Rack1 在調節(jié)這些組織中的鐵死亡中的潛在作用 （圖 4E）。隨后，進行顯微解剖以獲得正常和 ARM 胚胎的后腸組織。透射電子顯微鏡 （TEM） 顯示 ARM 組細胞線粒體體積減小，線粒體密度增加，線粒體嵴減少。這些觀察結果與與鐵死亡發(fā)生相關的線粒體形態(tài)變化一致（圖 4F）。
7.Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時空表達譜
之前描述了 Rack1 蛋白在 GD 15 泄殖腔區(qū)的定位（圖 2A），作者進一步研究了它在 GDs 14 和 16 泄殖腔區(qū)的定位。在正常胚胎 （N14） 中，Rack1 陽性信號主要在尿道和后腸的上皮細胞中觀察到，后腸遠端的濃度較高。這些信號也分散在 URS 和間充質細胞內。在 ARM 胚胎 （A14） 中，在 URS 尖端、后腸和尿道上皮觀察到 Rack1 陽性細胞（圖 5A）。比較分析顯示，N14 和 A14 組之間 Rack1 陽性信號的 AOD 沒有顯著差異（圖 5B）。在 GD 16 （N16） 的正常大鼠胚胎中，Rack1 表達在尿道和后腸上皮中仍然突出，但在 URS 和周圍間充質區(qū)域受到限制（圖 5A）。值得注意的是，A16 后腸區(qū)域的熒光強度降低 （p < 0.05），如圖 5B 所示，這說明了后腸區(qū)域的半定量 AOD 結果。
圖5-Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時空表達譜
8.敲低 Rack1 誘導腸上皮細胞鐵死亡
在 IEC-6 細胞中轉染 si-Rack1 后，使用 TEM 觀察細胞超微結構。si-Rack1 組表現出完整的細胞和核膜，線粒體大小減小，線粒體密度增加。此外，線粒體嵴減少或不存在，類似于 erastin 處理后觀察到的特征（圖 5C）。如 CCK-8 測定中觀察到的 Rack1 敲低導致細胞活力降低，LDH 測定所示，細胞毒性增加（p < 0.05；圖 5D）。使用 FerroOrange 探針的熒光分析表明 si-Rack1 組細胞內亞鐵離子濃度升高，在 Fer-1 處理后降低（p < 0.05；圖 5E）。使用 DCFH-DA 探針測量細胞內 ROS 水平顯示 si-Rack1 組的 ROS 水平較高，在 Fer-1 處理后下降（p < 0.05；圖 5F）。Liperfluo 探針評估揭示了 Fer-1 能夠減輕 si-Rack1 組中升高的脂質過氧化物水平 （p < 0.05；圖 5G）。熒光強度定量結果如右圖所示。
9.Rack1 敲低可增強 P38 磷酸化并調節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達
如前所述，MAPK 信號通路在后腸區(qū)域顯著富集（圖 3A）。在 IEC-6 細胞中轉染 si-Rack1 后，使用 MAPK 信號通路 PCR 陣列在 mRNA 水平上鑒定受 Rack1 影響的下游分子。使用閾值 |log2FC|≥ 2 和 p < 0.05 用于 PCR 陣列差異基因篩選，作者觀察到 si-Rack1 組中 P38δ （Mapk13 encoding） 的統(tǒng)計學顯著升高（圖 6A、B）。Western blot 分析顯示，Rack1 敲低后磷酸化 P38 水平增加（圖 6C、D），表明對 Rack1 的干擾增強了 P38 磷酸化，從而激活了 IEC-6 細胞中的 P38-MAPK 信號通路。隨后，使用鐵死亡 PCR 陣列篩選 si-Rack1 和 doramapimod 處理組之間表現出 mRNA 水平變化的基因，揭示了總共 7 個基因（圖 6E）。此外，這 7 個基因的表達豐度數據與現有研究報告相結合，將 Nqo1 確定為下游分子，以供進一步研究。Western blotting 分析顯示，doramapimod 處理逆轉了 Rack1 敲除誘導的 Nqo1 蛋白水平降低（圖 6F）。此外，在 si-Rack1 組中觀察到的 Gpx4 降低被 doramapimod 抑制，并通過 2-HBA 處理恢復（圖 6G）。
圖6-Rack1 敲低可增強 P38 磷酸化并調節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達
10.Rack1?通過 P38 和 Nqo1 介導腸上皮細胞中的鐵死亡
在 IEC-6 細胞敲低 Rack1 的同時，使用 doramapimod 和 2-HBA 進行拯救實驗。結果顯示，與單獨的 Rack1 敲低相比，添加 doramapimod 和 2-HBA 導致細胞活力增加和相對 LDH 含量降低 （p < 0.05；圖 6H，I）。此外，在添加 doramapimod 和 2-HBA 后，細胞內亞鐵離子濃度降低，同時 ROS 和脂質過氧化水平降低（p < 0.05；圖 6J-L）。這些發(fā)現表明，Rack1 通過P38信號通路和 Nqo1 調節(jié)細胞內鐵含量和脂質過氧化，從而介導腸上皮細胞的鐵死亡。
研究總結
本研究利用空間轉錄組學技術對 GDs 14-16 期間的正常和 ARM 大鼠胚胎樣本進行測序。作者在后腸區(qū)域鑒定了具有高連接性的新樞紐基因，即?Rack1 、 Uba52 、 Tpt1 、 Npm1?和?Eef1b2。相比之下，作者觀察到 MAPK 信號通路的顯著富集和 Gpx4 在后腸區(qū)域的差異表達。值得注意的是，Rack1?在 GDs 15 和 16 的 ARM 后腸中表達降低，通過 P38/Nqo1/Gpx4 軸升高細胞內鐵、ROS 和脂質過氧化水平，最終誘導腸上皮細胞鐵死亡，并可能影響 ARM 后腸發(fā)育。這些發(fā)現增強了作者對 ARM 發(fā)病機制的理解，并對推進 ARM 產前診斷和治療策略的研究具有重要意義。
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文章標題：Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution研究背景
陰莖勃起是一個復雜的生物學過程，整個過程需要神經、內分泌、血管和陰莖海綿體組織精密調節(jié)、協(xié)調完成。海綿體損傷可引起多種疾病，包括影響了5%~22%男性的陰莖勃起功能障礙（ED）。
ED不僅影響患者身心健康以及家庭和諧，還可能是心血管疾病的先兆。雖然目前已經知道在勃起發(fā)生和維持中不同功能區(qū)域的作用，但以往研究大多都依賴于解剖觀察、影像學檢查，以及少數基因或蛋白質的表達模式分析，缺乏全面的分子水平分析。
此外，多數ED相關研究是基于大鼠模型的，但當前對于大鼠和人類間陰莖海綿體（CC）的解剖學和信號網絡差異認識尚不清晰。因此，為了更好的使用大鼠模型開展研究，有必要深入研究大鼠陰莖海綿體的結構/功能調控與人類的異同。
材料方法
研究材料：4例陰莖癌患者，3例健康志愿者，10例DMED（糖尿病性勃起功能障礙）患者；4只健康大鼠，6只DMED大鼠模型。
研究方法：Masson/H&E染色（n=7），scRNA-seq（n=12，3例健康人類CC/3例DMED人類CC，3例健康大鼠CC/3例DMED大鼠CC），空間轉錄組技術（BMKS1000，n=3，1例陰莖腫瘤患者、1例勃起功能正常雄性大鼠以及1例DMED模型大鼠）等。
驗證實驗：包括油紅O/尼羅紅/菲律賓鏈霉菌染色、不同硬度ECM條件下培養(yǎng)的FB細胞形態(tài)信息及bulk RNA-seq數據、免疫熒光、超聲彈性成像。
研究結果
1.人類和大鼠CC細胞和空間特征
通過scRNA-seq數據，研究者在人類CC（陰莖海綿體）中鑒定出7種類型細胞，僅在大鼠CC中發(fā)現一小部分中性粒細胞和B細胞。使用scRNA-seq數據對空間轉錄組數據進行注釋（CellTrek），研究者得到了人類和大鼠CC樣本空間細胞分布圖譜（level3，20μm分辨度），發(fā)現雖然人類和大鼠CC中的細胞類型相似，但每種類型細胞比例、空間分布特征存在異質性。
圖1-通過scRNA-seq和空間轉錄組技術得到的人類，以及正常/DMED條件下大鼠的CC細胞全局表達譜
2.人類和大鼠CC組織中的空間異質性
作為一種特殊的血管竇結構，當前已初步認識到CC上不同區(qū)域的類型不同。得益于空間轉錄組技術，研究者發(fā)現人類CC組織中SVG（空間差異基因）top（如CCL18、PLA2G2A、C3）主要在不同類型細胞中表達，但有一些表現出空間分布特異性的基因并沒有在scRNA-seq數據中表現出細胞類型特異性；人類CC組織3個代表性區(qū)域中，不同區(qū)域的細胞比例不同，如區(qū)域I（海綿體動脈區(qū)域）EC（內皮細胞）占比更高，而區(qū)域III（白膜附近區(qū)域）包含更少的FB（成纖維細胞）但SMC（平滑肌細胞）豐富。大鼠CC組織也表現出相似的情況（大鼠CC中缺乏梳狀中隔和明顯的海綿體動脈，研究者根據人類CC代表性區(qū)域的空間位置，在大鼠CC中也劃分出可比較的3個代表性區(qū)域）。
圖2-人類CC組織的轉錄特征和空間異質性
3.根據scRNA-seq數據比較人類和大鼠CC中的細胞類型
多數勃起調控研究是基于大鼠模型的。為了理解大鼠和人類間CC微環(huán)境的異同，研究者通過分析scRNA-seq數據中的人—大鼠同源基因，發(fā)現雖然人類和大鼠物種不同，但CC中相同類型細胞仍可以聚成同一簇，進一步分析發(fā)現人類和大鼠CC中相同類型細胞的轉錄相似性>70%且正相關，表明在多數情況下，使用大鼠模型模擬、研究人類CC微環(huán)境的轉錄調控是可接受的。然而，人類和大鼠CC中相同類型細胞的DEGs（差異表達基因）top并不一致，提示當研究者更關注一個或幾個基因或通路時，使用大鼠模型要特別注意。
附錄圖7-scRNA-seq數據評估得到的大鼠和人類CC間相似性和差異性
4.比較人類和大鼠CC空間轉錄組全局
通過分析空間轉錄組數據中的人—鼠同源基因，研究者找到人類和大鼠共有的459個top SVG，大多數SVG并不是細胞類型特異的，其中EC、FB和SMC是表達這些SVG最多的3種類型細胞。富集分析結果顯示，基礎生物學過程如“translational initiation”、“extracellular structure organization”以及“protein targeting”，在人類和大鼠CC組織的空間轉錄組數據中是保守的；人類特異SVG主要與炎癥響應有關，而這些SVG的大鼠同源基因主要與代謝過程有關。
圖3-比較大鼠和人類CC微環(huán)境中的空間差異基因和信號通路
5.人類和大鼠CC微環(huán)境中的細胞—細胞互作分析
為了研究、比較人類和大鼠間CC微環(huán)境的復雜信號網絡，研究者使用scRNA-seq數據進行CellChat分析，發(fā)現大鼠CC中的細胞互作數量雖然小于人類，但細胞互作強度是相似的。基于這些互作的表達模式，研究者進行簡單的分類，發(fā)現雖然胞外基質相關的互作整體強度與細胞類型間配體-受體強度相當，但兩者基因組成是有差異的；血管生成相關的互作整體強度在人類和大鼠中沒有差異，但基因組成存在差異，如大鼠CC微環(huán)境中是主要是VEGFB表達，而人類CC微環(huán)境中高表達的是VEGFA和IGF1。
空間轉錄組數據顯示，VEGF配體主要集中富集在人類CC中的海綿體動脈（區(qū)域I）附近，而在蛋白質水平，VEGFA和IGF1并不共定位。大鼠中VEGF和IGF基因的空間分布模式與人類的相似，但蛋白質水平上區(qū)域I中存在高濃度的VEGFA和IGF1。此外，免疫相關的互作在人類CC與大鼠CC中表現出相似或者更高的整體信息流，但一些配體亞型在大鼠中高表達。
這些scRNA-seq數據的分析結果與基于空間轉錄組數據SVG的富集分析結果高度一致。
圖4-配體-受體對分析顯示人類和大鼠CC組織中的細胞—細胞通訊
6.EC表現出顯著的空間異質性和物種差異
根據以往的解剖觀察以及scRNA-seq數據分析，可知CC中包含3種類型EC（內皮細胞），包括GJA5+ EC（動脈內皮細胞）、SELP+ EC（靜脈內皮細胞）以及KIT+ EC（海綿體竇內皮細胞）。人類CC中GJA5+ EC占比最低，主要分布在海綿體動脈區(qū)域；SELP+ EC主要分布在白膜區(qū)域；KIT+ EC廣泛分布。但大鼠CC中，Selp+ EC比例更高，Gja5和Kit可能并不是有用的靜脈和CC內皮細胞標志物?；趕cRNA-seq數據進行GO分析，研究者發(fā)現不同類型EC富集了不同功能，多數細胞類型特異性的term（條目）在人類CC中并沒有空間分布異質性，但一些特殊term在大鼠CC中表現出空間分布異質性。
附錄圖10-人類和大鼠EC簇間的物種相似性和異質性
7.SMC表現出顯著的空間異質性和物種差異
根據以往研究結果，研究者將CC中的SMC（平滑肌細胞）簇分為VSMC（血管平滑肌細胞）和CCSMC（海綿體小梁平滑肌細胞）。數據分析結果顯示，兩種類型SMC在物種間存在顯著差異，其中人類CCSMC高表達DES，VSMC高表達RGS5；大鼠CCMS和VSMC可通過Igfbp2和Rgs5區(qū)分；蛋白質水平上，CCSMC與VSMC不同，后者不表達肌動蛋白或肌球蛋白；根據SMC的SVG空間分布模式，發(fā)現ACTC1/Actc1只在人類CCSMC中表達；前期研究發(fā)現ADRA2A在人VSMC表達，ADRA2C在人CCSMC中表達，空間轉錄組數據也驗證了這一發(fā)現，但大鼠CC中Adra2a并沒有表現出細胞類型特異性而Adra2c的表達未檢測到，提示在這個方面大鼠并不是合適的研究模型。
圖5-人類和大鼠SMC簇間的物種相似性和異質性
8.人類和大鼠FB有相似的聚類特征和空間分布，但亞型比例不同
近期，CC的FB（成纖維細胞）成為研究熱點，但對其空間和物種異質性仍不清楚。研究者根據PI16、APOE及其他載脂蛋白、COMP的表達情況，將人類CC FB分成3種亞群?？臻g轉錄組數據分析結果顯示，人類CC中3種FB亞群空間分布模式不同，富集的功能也不同；大鼠CC FB表現出與人類CC FB相似的亞群和標志基因，但每種亞群的比例與人類顯著不同。
APOE與脂滴轉運密切相關。油紅O染色顯示大鼠CC中脂滴位置與Apo+ FB的空間分布高度一致，且都在白膜下富集；免疫熒光染色結果顯示大多數脂滴與APOE蛋白共區(qū)域化出現且在白膜下有更高的富集，特別是在區(qū)域III（左右CC連接區(qū)域）；人類CC中APOE分布特征與大鼠類似但表達更廣泛。
前期研究成果顯示，FB是人類CC中最強的外向信號源，在調控微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。因而，FB表型轉變可能與CC結構和功能變化密切相關。通路活性分析顯示PI3K通路活性分值與APO+ FB有相似的空間分布模式，而TNF-α和TGF-β的空間分布模式與之相反；空間上CCSMC與FB相距較遠（level13，100μm分辨度分析FB生態(tài)位），而GJA5+ EC、VSMC、SWC（Schwann細胞）和T細胞與COMP+ FB空間距離較近，表明COMP+ FB與神經和血管密切相關；CXCLs、CCN2以及C3與3種FB亞群生態(tài)位正相關，但CCN5和C7與COMP+ FB生態(tài)位負相關，GREM1不與PI16+ FB或APO+ FB相關但與COMP+ FB生態(tài)位顯著正相關。
圖6-CC中不同成纖維細胞亞群表現出不同的空間分布特征
9.CC中機械力信號存在空間異質性，并調控FB表型轉變
以往研究表明病理條件下YAP信號誘導FB-肌成纖維細胞表型轉變，但這不能完全解釋生理條件下存在著的多種FB亞型，特別是有高脂質代謝活性的APO+ FB。有報道ECM（胞外基質）機械力調控多種細胞類型的脂質代謝。
本研究中，研究者發(fā)現COMP+ FB生態(tài)位顯著富集了“integrin-mediated signaling pathway”和“response to mechanical stimulus”term；人和大鼠CC中ECM/細胞組成比例表現出明顯的空間異質性；空間轉錄組數據和免疫熒光染色結果類似，靠近陰莖背神經血管束的上極區(qū)域顯示出較低的纖維化水平，而遠離背神經血管束的顯示出較高的纖維化水平；空間轉錄組數據和超聲彈性成像結果都表明，APO+ FB與更柔軟的組織硬度有關，而COMP+ FB與更硬的組織有關；不同胞外基質硬度培養(yǎng)下的CC FB形態(tài)不同，bulk RNA-seq數據顯示機械應激顯著改變了FB的轉錄狀態(tài)，一些參與調控脂質代謝的基因與低機械力信號有關；scRNA-seq數據分析結果顯示APO+ FB分值隨組織硬度增加而降低，COMP+ FB分值隨組織硬度增加而增加；染色結果顯示隨著組織硬度增加，FB中的中性脂質和膽固醇累積降低。
綜上，這些結果表明機械力信號直接參與調控FB的表型轉變。
圖7-局部機械力信號強度決定了這個區(qū)域內成纖維細胞的表型
10.人類和大鼠CC經歷了相似的DMED病理變化
為了更好的認識DMED病理條件下，人類和大鼠CC微環(huán)境發(fā)生的變化是否與每種CC細胞類型中發(fā)生的分子水平變化相一致，研究者通過分析scRNA-seq數據，發(fā)現DMED大鼠模型和DMED患者都經歷了顯著的纖維化以及細胞組分丟失，但兩者間的轉錄組差異顯著。富集分析結果顯示，僅DMED大鼠模型富集了“extracellular structure organization”；“actin cytoskeleton or organization”和“oxidative phosphorylation”僅在人類DMED患者SMC中發(fā)現，“regulation of MARK cascade”僅在DMED大鼠模型SMC中富集；“rhythmic process”僅在人類DMED患者FB中富集，“l(fā)eukocyte activation”僅在DMED大鼠模型FB中富集。
空間轉錄組數據顯示DMED大鼠模型陰莖中，除尿道以外的組織區(qū)域轉錄表達水平整體降低，而scRNA-seq數據顯示DMED狀態(tài)細胞的轉錄水平高于正常狀態(tài)的細胞，這或許意味著，可能是由于單位面積上細胞數量降低，導致空間轉錄組數據出現轉錄水平降低的現象。
附錄圖13-通過scRNA-seq和空間轉錄組評估DMED條件下CC的病理變化
研究總結
本文繪制了人類和大鼠陰莖海綿體（CC）的生理、病理條件下的空間轉錄組圖譜，結合多組學數據，系統(tǒng)比較了兩個物種間的異同。本研究成果為人類、大鼠陰莖海綿體的分子解剖學，以及跨細胞類型和區(qū)域的信號網絡提供了清晰洞見。同時在分子水平比較了人類和大鼠的陰莖海綿體異同，為理解動物模型的可用性提供基礎數據，推動臨床前實驗和臨床轉化更高效、可靠。文中還闡述了CC中機械力信號的空間分布異質性，并確認ECM機械信號可以調節(jié)FB表型轉變，提出靶向APO+ FB或可成為未來治療DMED的有效手段。最后，研究者也明確指出了本文中研究的局限性，為后續(xù)研究指明了方向。
參考文獻：
Yin et al, Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution. Cell Rep. 2024 Sep 24;43(9):114760. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114760. Epub 2024 Sep 18.
研究背景
表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 （EGFR-TKI） 是癌癥靶向治療的經典例子。已獲批的 EGFR-TKIs 單獨使用或與化療聯合用于治療非小細胞肺癌 （NSCLC）、結直腸癌 （CRC）、乳腺癌 （BC） 等。然而，大多數患者在 1-2 年后對 EGFR-TKI 產生獲得性耐藥，隨后癌癥復發(fā)和轉移。為了解決這一緊迫的臨床問題，迫切需要延遲和克服 EGFR-TKIs 耐藥的策略。到目前為止，獲得性 EGFR 突變、MET 擴增、ERBB2 擴增和旁路激活等作為 EGFR-TKI 耐藥的機制已得到充分研究。近年來，一些研究人員開始關注腫瘤免疫環(huán)境狀態(tài)與 EGFR-TKIs 治療療效之間的關系。臨床研究最近發(fā)現，EGFR-TKIs 治療可以重塑腫瘤免疫環(huán)境，但 EGFR-TKIs 與瘤周免疫細胞之間的關系尚未得到充分研究。
實驗材料
使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評估了對不同代 EGFR-TKI 的反應，揭示腫瘤耐藥機制。
進行天然小分子化合物庫 （MCE） 的篩選，制作了 266 個樣品。篩選 PD-1/PD-L2 結合抑制劑。
研究結果
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腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對 EGFR-TKIs 的耐藥性
首先，該研究使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評估了對不同代 EGFR-TKI 的反應。EGFR 突變或擴增存在于多種癌癥中，如非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌等。EGFR-TKIs 可以靶向 EGFR 敏感突變。因此，作者使用小鼠肺腺癌細胞 （LLC） 和結直腸癌細胞 （CT26） 作為工具細胞。作者用突變形式的人 EGFR 轉染小鼠細胞系 （LLC 和 CT26），攜帶外顯子 19 缺失 （EGFR19del） 或外顯子 21 L858R 錯義突變 （EGFRL858R），這會增加 EGFR 活性，以接近細胞模型到人類疾病，建立同基因荷瘤小鼠模型。在轉染 EGFR 突變體的細胞中，p-EGFR 和 p-ERK1/2 的表達增強，增殖速率顯著增加，表明細胞 EGFR 下游信號通路激活（圖 1A、B）。正如預期的那樣，EGFR 突變細胞對不同代 EGFR-TKI 更敏感，包括厄洛替尼、阿法替尼和奧希替尼（圖 1B）。為了全面探討 EGFR-TKIs 耐藥的機制，作者使用 EGFR 突變細胞建立了第一代和第三代 EGFR-TKIs 耐藥同基因小鼠模型（圖1C）。如圖1 D所示，第一代 （P1） LLC-EGFR19del 來源的腫瘤對奧希替尼敏感 （抑制率 = 44.0%）。在第 2 代 （P2） 中，作者將奧希替尼的劑量增加了一倍，腫瘤抑制率降低了一半 （22.2%）。用奧希替尼治療的第三代 （P3） LLC-EGFR19del衍生腫瘤被認為對奧希替尼耐藥，因為它們的體積與用生理鹽水治療的小鼠的體積沒有顯著差異。同時，作者還使用類似的方法成功獲得了對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFRL858R衍生腫瘤和對厄洛替尼耐藥的 CT26-EGFR19del衍生腫瘤（圖 1D）。
為了進一步研究 EGFR-TKIs 耐藥與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關系，作者將 P3 CT26-EGFR19del衍生的腫瘤接種到免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和嚴重免疫缺陷的 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中，然后作者評估了它們對厄洛替尼的反應性（圖 1E）。作者的結果表明，接種到 BALB/c 小鼠中的腫瘤對厄洛替尼治療保持耐藥性（抑制率 = 6.9%），而接種到 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中的腫瘤顯示出降低的耐藥性（抑制率 = 40.2%）（圖1E）。與體內腫瘤生長數據一致，增殖生物標志物 Ki67 的表達在用厄洛替尼處理后也顯示免疫缺陷異種移植腫瘤組織顯著減少，但在免疫活性異種移植腫瘤組織中沒有減少（圖 1F）?？傊?，這些結果表明腫瘤免疫環(huán)境參與 EGFR 突變腫瘤對 EGFR-TKI 的耐藥性。
圖1-腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對 EGFR-TKIs 的耐藥性
- 腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動態(tài)變化驅動 EGFR-TKIs 耐藥
為了了解腫瘤免疫環(huán)境如何參與對 EGFR-TKI 的耐藥性，作者分析了治療過程中不同階段的腫瘤免疫環(huán)境特征（圖 2A）。作者測定了初始 EGFR-TKIs 治療時和耐藥發(fā)展期間 （P1-P3） 腫瘤免疫環(huán)境中腫瘤浸潤白細胞 （TIL） 的密度，其中用鹽水處理的腫瘤細胞作為 CTRL 組，用厄洛替尼或奧希替尼治療的腫瘤細胞作為 TKI 組。流式細胞術分析的免疫分析顯示，在治療早期，攜帶 EGFR19del?的腫瘤的 EGFR-TKIs 治療誘導腫瘤浸潤白細胞比例增加（圖2B）。然而，當荷瘤小鼠對 EGFR-TKI 產生耐藥性時，與 CTRL 組相比，腫瘤浸潤白細胞的比例顯著降低（圖2B）。這表明荷瘤小鼠對 EGFR-TKIs 的反應性改變伴隨著腫瘤免疫環(huán)境的動態(tài)變化。
為了準確反映腫瘤免疫環(huán)境的真實狀態(tài)，作者檢查了藥物治療期間荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中的 T 細胞浸潤和功能。作者觀察到，兩種模型的 P1 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細胞比例均顯著增加，但隨著 TKI 治療的繼續(xù)，這種增加消失。TKI 耐藥 P3 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細胞的比例顯著降低（圖2C）。因此，作者假設 T 淋巴細胞，尤其是 CD8+?T 細胞，從最初的激活開始逐漸獲得功能失調的表型。為了檢驗這一假設，作者檢查了效應細胞因子在 T 細胞 （IFN-γ、IL-2、顆粒酶 B 和 TNF-α）中的表達。EGFR-TKIs 的初始治療刺激效應細胞因子的產生，但在耐藥發(fā)展的后期，效應細胞因子的水平似乎降低，并且與 CTRL 相比，IFN-γ 和顆粒酶 B 的產生顯著減少（圖2D， E）。這些結果表明 EGFR-TKIs 顯著影響腫瘤免疫環(huán)境。初始治療會引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應，從而顯著減少腫瘤生長。隨著時間的推移，EGFR-TKI 無法顯著控制腫瘤生長，并伴有 T 細胞浸潤和細胞因子產生的顯著減少。綜上所述，這些結果表明，隨著 EGFR-TKIs 治療時間的延長，腫瘤細胞由藥物敏感變?yōu)槟退帲庖叻磻紫仍鰪姾笠种啤?/p>
圖2-腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動態(tài)變化驅動 EGFR-TKIs 耐藥
- 對 EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達的上調
為了探索腫瘤免疫環(huán)境變化的原因，作者同時檢測了不同傳代階段腫瘤組織中刺激性和抑制性免疫調節(jié)分子的表達。在 EGFR-TKI 的初始治療中，一些抑制性免疫檢查點的相對表達降低（圖隨著耐藥性的出現，抑制性免疫檢查點基因 PD-L1 和 PD-L2 的相對表達水平逐漸升高，尤其是 PD-L2 （圖3A）。為了進一步驗證 PD-L2 在 EGFR-TKI 耐藥腫瘤細胞中表達的增加，作者通過流式細胞術鑒定了 PD-L2 在 P3 腫瘤細胞厄洛替尼或奧希替尼處理的腫瘤細胞（耐藥，TKI 組）表面的表達，以生理鹽水處理的細胞為對照（敏感，CTRL 組）。作者的結果表明，與對照組織相比，腫瘤細胞表面 PD-L2 的表達在耐藥腫瘤組織中表現出顯著增加（圖3B）。接下來，為了進一步驗證，作者分析了先前構建的 EGFR 突變的 TKI 耐藥 NSCLC 細胞系 HCC4006R、HCC827R、PC9R 及其配對親本細胞中免疫檢查點標志物的表達水平。在三種耐藥細胞系中，PD-L2 的 mRNA 和蛋白表達水平顯著上調，而 PD-L1 的表達表現出不一致的變化（圖3C、D）。
圖3-EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達的上調
為了探索這種現象的臨床價值，作者分析了臨床數據庫。使用 GEO 數據集，作者分析了 8 例 EGFR TKIs 治療前后切除的臨床患者肺癌組織中 PDCD1LG2?（編碼 PD-L2） 和其他免疫檢查點基因的變化。與作者的結果類似，作者觀察到 EGFR TKI 治療后患者組織中 PDCD1LG2?表達增加，但其他免疫檢查點相關基因沒有增加（圖3E）。此外，作者認為其他因素，例如 MET 擴增，可能涉及 EGFR-TKI 耐藥。作者利用 TCGA 數據集研究了 EGFR-TKIs 耐藥驅動基因的表達與人 CD274?（編碼 PD-L1） 或 PDCD1LG2?表達之間的關系。計算各驅動基因表達水平與 CD274?或 PDCD1LG2?表達水平之間的相關系數。結果表明，PD-L2 表達而不是 PD-L1 表達與 EGFR-TKIs 耐藥驅動基因的表達呈顯著正相關（圖 3F）。與體外實驗中的 PD-L1 過表達細胞相比，PD-L2 過表達的 PC9 細胞對上述耐藥驅動基因相關的抑制劑的抵抗力增強（圖3F）。這些結果與一些研究表明 EGFR-TKIs 耐藥機制與 PD-L1 表達有關的研究形成鮮明對比?？偠灾?，作者的結果提供了初步證據，表明 PD-L2 而不是 PD-L1 可能是介導 EGFR-TKIs 治療過程中腫瘤環(huán)境免疫抑制作用和驅動耐藥的關鍵分子。
- PD-L2 通過影響腫瘤免疫環(huán)境在介導 EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關鍵作用
為了研究 PD-L2 表達在免疫系統(tǒng)中的獨特作用和對 EGFR-TKI 的反應，作者在 CT26-EGFR19del?細胞系中過表達 PD-L1 和 PD-L2，并建立了 BALB/c 同基因小鼠模型（圖 4A）。使用攜帶空載體的 CT26-EGFR19del細胞系作為對照。作者通過測量腫瘤體積評估空載體組、PD-L1 過表達組和 PD-L2 過表達組小鼠腫瘤對厄洛替尼治療的敏感性。結果顯示，與空載體組相比，PD-L2 過表達組小鼠對厄洛替尼的腫瘤耐藥性顯著增加，但 PD-L1 過表達組對厄洛替尼的腫瘤耐藥性沒有增加（圖4B，C）。這些結果表明，PD-L2 的過表達會增加腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的耐藥性。為了進一步證實作者的發(fā)現，作者檢查了 PD-L1 或 PD-L2 過表達對 EGFR-TKIs 治療荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中 T 細胞浸潤和細胞因子產生的影響。結果顯示，CD4+?T 細胞占總 CD3+?T 細胞的比例在 3 組間差異不顯著。值得注意的是，與空載體組相比，PD-L2 過表達組的 CD8+?T 細胞占總 CD3+?T 細胞的百分比以及細胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 的表達顯著降低（圖 4D）。然而，PD-L1 過表達組中的細胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 沒有顯著變化（圖 4D）。免疫組化染色顯示，與空載體和 PD-L1 過表達組相比，PD-L2 過表達組腫瘤細胞增殖顯著增加（圖4E）。以上結果進一步表明，PD-L2 在厄洛替尼治療期間在抑制免疫反應、抑制細胞毒性 T 細胞浸潤和減少小鼠效應細胞因子產生方面起主導作用。因此，作者得出結論，在 EGFR-TKIs 治療過程中，PD-L2 水平升高通過介導腫瘤細胞的免疫逃逸來抑制腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的治療反應。
圖4-PD-L2 通過影響腫瘤免疫環(huán)境在介導 EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關鍵作用
鑒于 PD-L2 在體內調節(jié) T 細胞活性中的關鍵作用，作者通過體內實驗表明，PD-L2 的穩(wěn)定沉默增加了 EGFR-TKI 的敏感性（圖4F，G）。為了進一步研究 PD-L2 如何影響對 EGFR-TKI 的耐藥動力學，作者在 EGFR-TKI 耐藥同基因小鼠模型的開發(fā)中穩(wěn)定地沉默了 CT26-EGFRmut 細胞系中的 PD-L2（圖4H）。結果顯示，厄洛替尼在第一代顯著抑制 CT26-EGFR19del?衍生腫瘤的生長。重要的是，PD-L2 沉默導致對 EGFR-TKI 治療的耐藥性延遲發(fā)生。即使在第三代 （P3） 時對照組 （CT26-EGFR19del?shNC 衍生腫瘤） 出現耐藥性 （腫瘤抑制率 = 13.5%），PD-L2 沉默的腫瘤對 EGFR-TKIs 保持高敏感性 （腫瘤抑制率 = 52.7%） （圖4I，J）。綜上所述，作者的基因操作實驗表明，PD-L2 通過影響腫瘤免疫微環(huán)境在介導 EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關鍵作用。
- 阻斷 PD-L2/PD-1 聯合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細胞或腫瘤的生長
接下來，作者想進一步探討阻斷 EGFR-TKI 耐藥細胞中的 PD-L2/PD-1 是否可以通過增強免疫反應來增強腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性。作者建立了攜帶對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水 （CTRL）、奧希替尼 （Os）、抗 PD-1 （αPD-1） 和奧希替尼 + 抗 PD-1 （Combi） 治療（圖5A）。作者的結果表明，與 CTRL 組相比，單獨使用奧希替尼組小鼠的腫瘤體積和生存時間沒有顯著差異。PD-1 抑制劑對 EGFR-TKI 耐藥腫瘤表現出部分抑制，并導致小鼠存活時間適度延長，盡管沒有統(tǒng)計學意義。然而，奧希替尼和抗 PD-1 的組合顯著抑制了腫瘤生長并延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖5B，C）。以上結果表明，抑制 PD-1 與 EGFR-TKI 聯合有效抑制了 EGFR-TKI 耐藥腫瘤的生長。
此外，作者進一步確定了在耐藥細胞中穩(wěn)定敲低 PD-L2 是否可以增強這些細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性，為了區(qū)分 PD-L1 和 PD-L2 的作用，作者生成了 PD-L1 和 PD-L2 穩(wěn)定沉默的 PC9R 細胞系。與 PD-L1 沉默細胞相比，PD-L2 沉默的腫瘤細胞對 EGFR-TKI 更敏感，它們更有效地增加了 T 細胞的增殖和 CD8+?T 細胞的比例（圖5D，E）。此外，作者使用抗體阻斷 PD-L1、PD-L2 和 PD-1 的功能獲得了一致的結論。抗 PD-L2 和 PD-1 的抗體使腫瘤細胞對 EGFR-TKI 更敏感，并增加了 T 細胞的增殖，CD8+ T 細胞的比例更高（圖5F， G）。上述體內和體外實驗表明，PD-L2 的高表達通過影響免疫反應來影響 EGFR 突變細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性。因此，PD-1/PD-L2 信號傳導，而不是 PD-1/PD-L1 信號傳導，可能在介導對 EGFR-TKI 的耐藥中發(fā)揮重要作用。
圖5-阻斷 PD-L2/PD-1 聯合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細胞或腫瘤的生長
- PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥
接下來，作者進一步探討了 PD-L2 表達升高影響免疫反應以降低腫瘤對 EGFR-TKIs 敏感性的機制。作者獲得了來自空載體或 PD-L2 過表達的同基因小鼠中 CT26-EGFR19del?細胞的腫瘤組織的單細胞轉錄組譜。作者對來自空載體樣本和 PD-L2 過表達樣本的整合單細胞數據集進行了聚類分析，并確定了六個主要的不同細胞群（圖6A、B）。作者發(fā)現 PD-L2 過表達組中癌細胞的數量顯著增加，T 細胞的比例顯著降低（圖6C）。為了探索 EGFR-TKIs 耐藥的機制，作者分析了癌細胞的轉錄組特征。與空載體組相比，對 PD-L2 過表達組的差異表達基因進行 KEGG 富集分析。作者觀察到細胞凋亡通路顯著富集（圖 6D）。GSEA 分析顯示，PD-L2 過表達組癌細胞中與細胞凋亡途徑相關的基因顯著下調（圖6E）。這些結果表明，EGFR 突變腫瘤細胞中 PD-L2 表達的增加可導致細胞凋亡減少。作者的體內實驗數據進一步驗證了這些結論。TUNEL 染色顯示，與對照組相比，TKI 處理后 CT26-EGFR19del?PD-L2 過表達組腫瘤細胞凋亡受到顯著抑制（圖6F）?；谶@些結果，作者假設 EGFR 突變的腫瘤細胞中 PD-L2 表達增加會抑制癌細胞的凋亡，從而導致癌細胞的持續(xù)生長，耐藥性增加。
圖6-PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥
- PD-L2 過表達抑制 CD8+T 細胞通過穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導腫瘤細胞凋亡的功能
為了進一步了解 PD-L2 對腫瘤免疫環(huán)境的抑制作用，作者回到了作者的單細胞測序數據。根據 CD45 的表達，將空載體和 PD-L2 過表達組的腫瘤環(huán)境中細胞分為 CD45-?腫瘤細胞和 CD45+?免疫細胞（圖7A）。然后根據已知遺傳標記的表達和細胞亞群的特異性注釋對 CD45+?免疫細胞進行分組（圖 7B）。在 PD-L2 過表達組中，作者觀察到 CD8+?T 細胞群的大小顯著減?。▓D7B，C）。因此，作者通過 KEGG 富集分析了空載體組和 PD-L2 過表達組 CD8+?T 細胞中的差異表達基因（圖 7D）。作者發(fā)現與增殖和細胞毒功能相關的通路顯著富集（圖7E）。為了進一步證實 PD-L2 過表達顯著影響 CD8+?T 細胞活性，作者從總 T 細胞中分離 CD8+?T 細胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養(yǎng)。結果顯示，CD8+?T 細胞的增殖在 PD-L2 過表達細胞中受到顯著抑制，而在 PD-L1 過表達細胞中則不受抑制（圖7F）。然后，作者從總 T 細胞中分離 CD4+?T 細胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養(yǎng)。值得注意的是，PD-L2 過表達對 CD4+?T 細胞的增殖沒有影響，而 PD-L1 過表達顯著抑制了 CD4+?T 細胞的增殖（圖7G）。這表明 PD-L2 和 PD-L1 介導 T 細胞抑制的分子機制存在差異。
許多研究表明，CD8+?T 細胞可通過 Fas-FasL 通路或穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導腫瘤細胞凋亡。因此，作者接下來使用純化的 CD8+?T 細胞與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養(yǎng)，并研究 EGFR-TKIs 處理后腫瘤細胞的凋亡情況。結果顯示，與 PD-L1 過表達細胞相比，PD-L2 過表達減少了 EGFR-TKI 處理后 CD8+?T 細胞介導的腫瘤細胞凋亡（圖7H）。接下來，作者試圖檢查腫瘤細胞 PD-L1 或 PD-L2 過表達對 CD8+?T 細胞分泌細胞毒性細胞因子的影響。正如預期的那樣，與 PD-L1 過表達相比，PD-L2 過表達顯著抑制了 CD8+?T 細胞顆粒酶 B 和穿孔素伴隨 EGFR-TKI 治療的分泌（圖7I）。綜上所述，EGFR 突變腫瘤細胞中 PD-L2 的過表達顯著抑制了 CD8+?T 細胞的增殖和細胞毒功能，主要是通過抑制穿孔素和顆粒酶 B 的分泌，從而減少腫瘤細胞的凋亡。
圖7-PD-L2 過表達抑制 CD8+?T 細胞通過穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導腫瘤細胞凋亡的功能
- ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評價
由于目前市場上沒有靶向 PD-L2 的藥物，作者使用 HTRF 技術篩選了 1300 多種天然小分子化合物的庫，以鑒定 PD-L2 的特異性抑制劑。作者發(fā)現了一種小分子化合物十一烯酸鋅 （ZU），它選擇性地抑制 PD-L2/PD-1 結合，EC50?8.4 μM，而 PD-L1/PD-1 為 >80 μM（圖8A， B）。ZU 是由蓖麻油通過一系列化學反應和凈化過程生產的。CETSA 實驗表明，與 PD-L1/PD-1 相比，ZU 有效抑制了 PD-L2 與 PD-1 的結合（圖8C）。這些結果表明 ZU 具有阻斷 PD-L2/PD-1 相互作用的特異性能力。此外，作者利用空載體或 PD-L2 過表達的小鼠 CT26 細胞來驗證 ZU 的體外抗腫瘤作用。在 40 μM 濃度下，ZU 不會顯著降低 CT26 空載體和 PD-L2 過表達細胞的活力（圖8D），這表明 ZU 沒有直接的細胞毒性作用。然而，當腫瘤細胞與活化的 T 細胞共培養(yǎng)時，與 CT26 空載體細胞相比，ZU （40 μM） 顯著抑制了 CT26 PD-L2 過表達細胞的活力（圖8D）。這表明 ZU 通過靶向 PD-L2/PD-1 的免疫調節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。使用具有空載體和 PD-L2 過表達的 PC9 細胞獲得了類似的結果（圖8D）。此外，作者研究了 ZU 和 EGFR-TKI 對親本和 TKI 耐藥 NSCLC 細胞的聯合抑制作用。對于耐藥細胞，結果表明，厄洛替尼聯合 ZU 對 827 R 或 PC9R 細胞的生長抑制具有協(xié)同作用，與單獨使用厄洛替尼相比，耐藥細胞的存活率顯著降低（圖8E）。重要的是，在沒有活化的 T 細胞的情況下，厄洛替尼聯合 ZU 的細胞殺傷效果沒有顯著差異（圖8E）。上述結果進一步表明，靶向 PD-L2 的 ZU 與 EGFR-TKI 的組合對耐藥腫瘤表現出協(xié)同抑制作用。
接下來，作者評估了 ZU 是否通過靶向 PD-L2 可以改善腫瘤免疫反應。流式細胞術分析顯示，與單獨使用厄洛替尼或 ZU 相比，厄洛替尼聯合 ZU 顯著增加了 CD8+?T 細胞的比例和顆粒酶 B 的表達（圖8F，G）。作者進一步檢測到與活化 T 細胞共培養(yǎng)的 827 個 R 或 PC9R 細胞的凋亡水平。作者發(fā)現厄洛替尼聯合 ZU 顯著促進免疫細胞介導的 EGFR-TKI 耐藥細胞凋亡（圖8H）。相比之下，當用厄洛替尼加 ZU 處理耐藥細胞時，在沒有活化的 T 細胞或細胞凋亡抑制劑（泛半胱天冬酶抑制劑 Z-VAD-FMK 和特異性顆粒酶 B 誘導的細胞凋亡抑制劑 Z-IETD-FMK）的情況下未觀察到細胞凋亡（圖8H）。這進一步證明了耐藥細胞的凋亡是由免疫細胞介導的。此外，顆粒酶 B （Z-IETD-FMK） 的抑制有效地消除了細胞凋亡，突出了顆粒酶 B 在 ZU 和 EGFR-TKI 誘導的耐藥癌細胞凋亡中的關鍵作用（圖8H）?？傊@些結果表明天然小分子抑制劑 ZU 可以有效和特異性地抑制 PD-L2。當與 EGFR-TKIs 聯合使用時，ZU 可以通過在體外激活免疫細胞介導腫瘤細胞凋亡來顯著逆轉腫瘤細胞的耐藥性。
圖8-ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評價
- ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內逆轉 EGFR-TKIs 耐藥
為了進一步證實 ZU 和 EGFR-TKIs 的組合協(xié)同改善腫瘤免疫環(huán)境并逆轉腫瘤耐藥性，作者評估了 ZU + 厄洛替尼在攜帶 PD-L2 過表達的 CT26-EGFR19del?來源的腫瘤的 BALB/c 同基因小鼠中的療效（圖9A）。腫瘤體積曲線顯示，與鹽水處理組相比，單獨使用厄洛替尼在治療 15 天后表現出邊緣性腫瘤生長抑制（圖9B），這表明 PD-L2 的過表達增加了腫瘤細胞對 TKI 的耐藥性。ZU 單次治療并未阻斷腫瘤生長（圖9B），這表明單獨靶向 PD-L2 不能逆轉厄洛替尼耐藥性。正如預期的那樣，陽性對照組 （Er + ADVshPD-L2） 在所有測試的模型中反應最好（圖9B）。此外，ZU + 厄洛替尼組與陽性對照組相比沒有顯著差異，這表明 ZU 可以有效抑制 PD-L2，并且當與厄洛替尼聯合使用時，可以顯著逆轉厄洛替尼耐藥性（圖9B）。此外，流式細胞術和免疫組化結果顯示，聯合治療增加了腫瘤組織中浸潤白細胞（CD45+）的比例、T 細胞的活化 （CD3+CD69+）以及CD8+?T 細胞（CD8+GzmB+）的比例和功能（圖9C）。免疫組化顯示，聯合治療顯著抑制了增殖（圖9D）。為了全面評價 EGFR-TKIs 聯合 ZU 的療效，作者建立了攜帶對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤和對厄洛替尼耐藥的 CT26 EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水（CTRL）、單獨 EGFR-TKIs、 單獨 ZU和EGFR-TKIs + ZU處理。作者的結果表明，與生理鹽水組相比，單獨使用 EGFR-TKIs 組或單獨使用 ZU 組小鼠的生存時間沒有顯著差異（圖9E， F）。然而，ZU 和 EGFR-TKIs（奧希替尼或厄洛替尼）的組合顯著延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖9E，F）。這些結果表明，ZU 聯合 EGFR-TKIs 可以通過改善同基因小鼠模型中的腫瘤免疫環(huán)境來有效逆轉對 EGFR-TKIs 的耐藥性。綜上所述，ZU 通過抑制 PD-L2 增強 CD8+?T 細胞的功能，其與 EGFR-TKIs 的聯合作用可有效抑制耐藥腫瘤的增殖。
圖9-ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內逆轉 EGFR-TKIs 耐藥
研究總結
在該研究中，由于難以獲得對?EGFR-TKIs?耐藥的臨床腫瘤樣本，作者使用轉染人?EGFR?突變體 （外顯子19?缺失） 的小鼠細胞系建立?EGFR-TKI?耐藥同基因小鼠模型約五個月，這是使用基因工程小鼠難以實現的。值得注意的是，該研究的?TKI?耐藥模型的關鍵點是將初始抑制率與不同傳代模型中的抑制率進行了比較，例如?Os?治療的?LLC?從?44%?到?-12.3%，Er?治療的?CT26?從?55%?到?11.2%。因此，該研究認為該模型可以反映臨床?TKI?給藥中的耐藥過程。這種方法使作者能夠研究?EGFR-TKIs?治療過程與腫瘤免疫環(huán)境之間的關系。作者的結果表明，EGFR-TKIs?對腫瘤免疫環(huán)境具有顯著而顯著的影響。當?EGFR-TKIs?治療有效時，抗腫瘤免疫反應增強。然而，當發(fā)生耐藥性時，作者觀察到腫瘤浸潤白細胞的比例顯著降低，CD8+?T?細胞的比例和功能降低。不斷變化的腫瘤免疫環(huán)境可能是?PD-1?阻斷治療后立即再次用?EGFR-TKIs?攻擊對?EGFR-TKI?耐藥的?NSCLC?患者有效的原因 。此外，作者得出結論，抑制性腫瘤免疫環(huán)境是參與對?EGFR-TKIs?耐藥的機制之一。因此，作者從非遺傳角度揭示了?EGFR-TKIs 耐藥的新機制。
2024年8月21日，北京大學崔一民、安徽醫(yī)科大學王華教授共同通訊在Journal of Hepatology期刊在線發(fā)表題為“Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids”的研究論文。研究團隊運用宏基因組、單細胞轉錄組和代謝組組學研究了甲狀腺激素受體-β激動劑HSK31679在改善代謝相關脂肪性肝炎（MASH）方面的作用，并探究了腸道菌群在其中扮演的角色。研究發(fā)現，HSK31679能夠有效改善SPF小鼠的MASH，但無菌小鼠則沒有這種效果，說明腸道菌群在HSK31679的治療中起到了關鍵作用。研究還發(fā)現，HSK31679能夠增加腸道擬桿菌thetaiotaomicron的相對豐度，并抑制其萄糖神經酰胺合成酶（GCS）活性，從而減少腸道微生物鞘脂的單糖基化，進而改善肝臟脂肪積累。此外，HSK31679還能夠重塑髓系細胞動態(tài)，使其向抗炎微環(huán)境轉變，從而進一步減輕MASH。
文章標題：Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids
發(fā)表期刊：Journal of Hepatology
影響因子：26.8
合作單位：北京大學
研究對象：小鼠模型、臨床隊列
研究方法：微生物多樣性測序，宏基因組測序，代謝組檢測
百邁客生物為該研究提供了微生物多樣性測序，宏基因組測序，代謝組檢測服務。
研究背景
甲狀腺激素受體-β (THR-β) 激動劑，如 MGL-3196 和 HSK31679，因其對 THR-β 的選擇性高而被認為是治療 MASH 的新興藥物。MGL-3196在臨床試驗中表現出良好的療效，但其個體臨床療效差異較大，且存在腸道通透性差的問題。HSK31679 是 MGL-3196 的衍生物，其療效和安全性正在進一步研究中。腸道微生物組與宿主的代謝健康密切相關，其組成和功能的改變與 MASH 的發(fā)生發(fā)展密切相關。腸道微生物可以產生多種酶，參與宿主血漿脂質代謝，并可能影響 THR-β 激動劑的活性。該研究旨在探索腸道微生物在 THR-β 激動劑治療 MASH 中的作用，評估 HSK31679 的療效和機制以及為 MASH 的治療提供新的思路和靶點。
材料方法
1.動物實驗
對無菌小鼠和 SPF 小鼠進行高脂飲食誘導的 MASH 模型構建，分別給予 MGL-3196 和 HSK31679 治療，觀察肝脂肪變性程度和肝臟指標變化。
對 SPF 小鼠進行?B. thetaiotaomicron 菌株定殖，觀察 HSK31679 對 MASH 模型的影響。
2.微生物組分析：
對參與者的糞便進行宏基因組測序，分析腸道菌群組成變化。
對參與者的糞便和血清進行脂質組學分析，檢測腸道微生物產生的鞘脂類物質變化。
3.單細胞 RNA 測序：
對18例PBMC樣本進行單細胞轉錄組測序，分析 HSK31679 對免疫細胞的影響。
研究結果
1.HSK31679 在 SPF 小鼠中優(yōu)于 MGL-3196 治療高脂飲食誘導的 MASH
為了研究THR-β激動劑治療 MASH對腸道微生物群的影響，研究者在沒有腸道微生物定群的情況下飼養(yǎng)的C57 BL/6 GF小鼠喂食高脂肪、果糖和膽固醇飲食（MASH飲食）和SPF對照組16周。然后每日給予MGL-3196或HSK 31679 3毫克/kg劑量，口服，持續(xù)8周（圖1A）。如圖1B所示，MGL-3196灌胃對SPF和GF小鼠的體重均沒有明顯影響，而HSK 31679導致SPF小鼠的體重增加具有統(tǒng)計學意義，但GF小鼠沒有。服用MASH飲食然后接受MGL- 243 3196/HSK 31679處理的SPF小鼠表現出肝臟重量明顯下降（p < 0.01;圖1C），HSK31679 組 SPF 小鼠的體重增加、肝臟重量、血清和肝臟甘油三酯和膽固醇水平、血清 ALT、AST 和 GGT 水平以及肝臟脂質變性程度均顯著低于 MGL-3196 組。HSK31679 組 SPF 小鼠的肝臟炎癥和纖維化相關基因表達水平也顯著低于 MGL-3196 組。無菌小鼠模型中，MGL-3196 和 HSK31679 組的 MASH 病理表現相似，表明 HSK31679 的療效依賴于腸道菌群。
圖1-HSK31679在改善MASH飲食誘導的SPF小鼠脂肪性肝炎方面優(yōu)于MGL-3196，但在改善GF小鼠方面則不然
2.HSK31679 治療增加了腸道 B. thetaiotaomicron?的相對豐度
在MASH飲食喂養(yǎng)16周和HSK31679治療8周后，觀察到SPF小鼠富含腸道擬桿菌thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）（圖1I、J和S2D）。NMDS和PCA分析表明HSK31679重塑了β多樣性譜，而每組腸道微生物群的Shannon和Simpson多樣性指數略有差異（圖S2G和H）。在微生物功能方面，通過KEGG分析富集的7,458條功能途徑。其中22條途徑在HSK31679治療后有所不同，包括參與激活神經鞘脂（SL）代謝的途徑，在HSK31679實驗組中，B. thetaiotaomicron與上調的己糖神經酰胺加工基因密切相關（圖1L）。
為了臨床驗證微生物組組成的這種轉變，研究者收集了40名健康參與者的糞便樣本，這些參與者接受了每周3次的HSK31679多次遞增劑量治療，持續(xù)14天。對參與者的糞便進行宏基因組測序分析，鑒定了代表183個科和119個屬的415種微生物物種。香農和辛普森多樣性指數在兩組中幾乎沒有受到HSK31679治療的影響（圖S3A和B）。相比之下，PCA評分和NMDS均顯示了HSK31679處理14 d后腸道微生物群β多樣性譜的顯著變化。對51個不同的細菌屬進行屬級微生物Spearman相關網絡分析，發(fā)現HSK31679處理后有幾個屬與擬桿菌屬呈正相關（圖S3D）。
隨后通過LEfSe分析探索了HSK31679治療組14天與安慰劑組相比的腸道菌群差異，這進一步揭示了桿菌屬的最大增量（圖2B，C）。值得注意的是，在第14天上升劑量為80mg、120mg、160mg HSK31679后，B. thetaiotaomicron的相對豐度表現出最明顯的逐漸上升（圖2C），并通過qPCR進行了驗證（圖2D），這表明B.thetaiotaomicron可能在HSK31679治療期間發(fā)揮關鍵中介作用。KEGG通路分析富集了20個信號通路的154個功能基因，其中神經酰胺代謝被HSK31679處理激活（圖2E）。這些顯著的成分變化與以前對晚期脂肪性肝炎患者微生物種群負相關的研究一致。
圖2-HSK31679治療在遞增的多劑量隊列中豐富了腸道擬桿菌thetaiotaomicron的豐度
3.HSK31679 治療抑制了?B. thetaiotaomicron?產生的鞘脂類物質的單糖基化過程
基于 B. thetaiotaomicron?的 SLs 可以轉移以調節(jié)肝臟脂肪變性這一認識，隨后研究者試圖確定 HSK31679 314 治療是否已深入調節(jié) SLs 表型。對接受多次遞增劑量 HSK31679 316 和安慰劑治療的參與者的糞便代謝物進行脂質組學分析，發(fā)現?HSK31679 治療顯著降低了腸道 B. thetaiotaomicron?產生的鞘脂類物質（如 Hex1Cer 和 Hex2Cer）的單糖基化程度。
HSK31679 治療組的腸道菌群與鞘脂類物質之間存在顯著的負相關關系，HSK31679 治療的綜合統(tǒng)計相關性分析證實，擬桿菌和普雷沃氏菌與 C16:0 和 C24:1 ?；湹募禾巧窠涻０烦守撓嚓P（圖 3D）。這表明口服 HSK31679 治療可抑制微生物對神經酰胺的單糖基化。
圖3-HSK31679治療損害了微生物鞘脂單葡萄糖基化
4.thetaiotaomicron 的 GCS 活性對 HSK31679 減輕 MASH 的作用至關重要
進一步研究了HSK 31679介導的SLs 單糖基化的潛在機制。通過體外共培養(yǎng)實驗和體內無菌小鼠模型，發(fā)現 HSK31679 治療抑制了 B. thetaiotaomicron?的 GCS 活性。在無菌小鼠模型中，B. thetaiotaomicron?GCS 活性缺失的小鼠對 MGL-3196 和 HSK31679 的療效沒有顯著差異，而 GCS 活性存在的小鼠對 HSK31679 的療效顯著優(yōu)于 MGL-3196。HSK31679 與 B. thetaiotaomicron GCS?的結合結構分析表明，HSK31679 通過空間位阻效應抑制了 GCS 的活性。
圖4-GCS是HSK31679減輕脂肪性肝炎不可或缺的酶
5.HSK31679治療的單細胞圖譜
為了深入了解腸道微生物GCS在所有免疫細胞群中治療HSK31679的獨特免疫作用，研究者使用基于液滴的單細胞平臺（10×Genomics Chromium）進行了單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），分析了來自參與者隊列的18個外周血單核細胞（PBMC）樣本，包括3個用安慰劑（GH-PL）治療的糞便來源GCS高活性樣本、3個用160 mg HSK31679（GH-HS）治療的糞便來源GCS高活性樣本，和GCS低活性樣本（GL-HS）分別在第0天和第14天。從GH-PL、GH-HS、GL-HS數據集中獲得的128031個細胞中，共鑒定出57個細胞簇。通過SingleR v.1.0獲得的基于標記的注釋，定義了四種主要的細胞類型：T細胞、自然殺傷細胞（NK）和B細胞、髓系細胞、內皮細胞（EC）和間充質細胞（圖5B）。通過計算觀察到的細胞數與預期細胞數的比值（Ro/e）來量化主要細胞團相對不同的富集情況，發(fā)現髓系細胞團構成了GH-HS的主要改變的細胞成分，B細胞、EC團主導了GL-HS樣本的細胞成分（圖5C、D和圖S8C）。鑒于如上所述，HSK31679治療通過B.thetaiotaomicron的GCS減輕了脂肪性肝炎，在隨后分析GH-HS和GL-HS之間的特定細胞區(qū)室時重點研究了髓系細胞。
圖5-160 mg HSK31679治療隊列的單細胞圖譜
6.HSK31679 治療重塑了髓系細胞的動態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境
在所有髓系細胞亞群中，樹突狀細胞 (DC) 和巨噬細胞 (Mφ) 構成了主要細胞類型（圖 5B）。通過無監(jiān)督聚類，首先關注 DCs 群體的內在屬性和潛在功能，這些 DCs 群體被確定為減少的 CD8α+DCs（圖 6A、D）。值得注意的是，GH-HS 組中 Tregs 的 IL-12Rβ2 可以與 CD8α+DCs 衍生的 IL-35 相互作用（圖 6B、C）。如先前報道的那樣，可以增強炎癥過程的抑制功能。與GL-HS或GH-PL數據集相比，GH-HS的PBMCs中CD4+Foxp3+Tregs的數量增加（圖6D）。這些Tregs的抑制功能阻斷了IL-35的EBI3亞基的作用（圖6E），導致免疫原性顯著受損。這可能是由于STAT1/STAT3的異常激活和p38 MAPK/NF-κB信號通路的抑制（圖S8D和E）。此外，注意到DC簇的分布與γ-谷氨酰轉移酶（GGT）的表達相關（圖6B），GGT是MASH進展的公認血清生物標志物。在GH-HS的所有DC中（圖6A），GGT+樣本中CD1C+DCs（cDC2）的比例顯著增加，而與GL-HS或GH-PL組相比，DEC205+DCs（cDC1）的比例降低。盡管之前的研究報告了cDCs在促進或抑制脂肪性肝炎中的不確定作用，但結果表明，cDC1和cDC2細胞對HSK31679治療的反應方式相反。
圖6-HSK31679介導的抗炎髓細胞動力學減輕脂肪性肝炎進展
對于巨噬細胞部分，通過無監(jiān)督聚類產生了6個具有不同基因特征的聚類。對兩個富含非經典單核細胞簇的PBMCs進行了表征：MINCLE+Mφ和S1PR2+Mφ。根據常規(guī)表型標記物（TREM2+、MRC1+、CD163+、AGR1+）的高表達，其余簇均被鑒定為巨噬細胞（圖6A）。值得注意的是，巨噬細胞簇MINCLE+Mφ、S1PR2+Mφ和AGR1+Mφ顯示出相對不同的發(fā)展（圖6F、G）。在這些巨噬細胞簇中，AGR1+Mφ和MINCLE+Mφ是GH-HS和GL-HS組中改變的主要亞群，而S1PR2+Mφ在GH-HS組更具特征（圖5C）。然后研究了它們的不同功能狀態(tài)，并觀察到趨化因子（CCL3/15和CXCL10/12/14）在GH-HS中的表達降低，但在GL-HS樣本中沒有，這表明其是由這些Mφ簇募集T細胞的過程。GH-HS樣本的細胞相互作用分析也證實，抗炎巨噬細胞通過CCL3/15-CCR5、CXCL10/11-CXCR5和CXCL12/14-CXCR4信號傳導積極參與T細胞的募集（圖6C和S9B）。在GL-HS組中，MRC1+Mφ表達的CCL15/CXCL10水平升高，AGR1+Mφ高度表達CCL2/CXCL12（圖S9B）；而GH-HS組CCL22簇的優(yōu)勢Mφ從MINCLE+Mφ切換（圖6H和S9D），其AGR1+Mφ上調了RPS27、CDKN1C和KLRF1的表達水平（圖S10B），表明經HSK31679處理的糞便來源GCS+參與者的巨噬細胞發(fā)生了重編程。總結HSK31679治療的上述代謝指標，GCS活性和糞便中B.thetaiotaomicron的相對豐度與肝臟ΔTG、ΔTC和ΔGGT水平等呈顯著負相關（圖6I）。這些結果表明，B.thetaiotaomitron介導的免疫抑制的GCS活性可能預測HSK31679治療個體的MASH緩解。
研究總結
該研究描繪了HSK31679通過抑制腸道微生物鞘脂的單糖基化來改善MASH的新圖譜。這項研究為腸道微生物和循環(huán)免疫因素提供了新的見解，這些因素可以作為MASH患者HSK31679治療的預后標志物，以及基于腸道微生物群的MASLD治療的新靶點或策略。對于甲狀腺模擬物的進一步4期上市后研究，應系統(tǒng)地調查大規(guī)模隊列，研究抗菌組合對MASH個體長期結果的影響。
文章亮點
該研究證明了腸道微生物在 THR-β 激動劑治療 MASH 中的重要作用。發(fā)現 HSK31679 通過抑制腸道 B. thetaiotaomicron?產生的鞘脂類物質的單糖基化過程來減輕 MASH。揭示了腸道 GCS 活性可以作為 HSK31679 治療 MASH 的預測生物標志物。發(fā)現 HSK31679 治療重塑了髓系細胞的動態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境。
參考文獻：
Zhang YH, Xie R, Dai CS, et al. Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids. J Hepatol.?Published online August 22, 2024. doi:10.1016/j.jhep.2024.08.008
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文章標題：Single-cell BCR and transcriptome analysis reveals peripheral immune signatures in patients with thyroid-associated ophthalmopathy
期刊名稱：Aging.
合作單位：寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院
研究部位：眼
研究方法：scRNA-seq、scBCR-seq、流式細胞術
百邁客生物為該研究提供了單細胞測序服務。
研究背景
甲狀腺相關性眼病（Thyroid-associated Ophthalmopathy， TAO）是一種眼眶特異性自身免疫性疾病，可導致毀容，并可能導致失明。目前，TAO的病因尚不清楚。TAO可與甲狀腺功能亢進癥、甲減癥合并使用，甲狀腺功能正常的患者數量逐年增加。它是一種器官特異性自身免疫性疾病，與甲狀腺功能有關，相對獨立。具有特征性眼部體征的TAO的常見癥狀是眼瞼回縮，伴或不伴眼突出，占所有 TAO的70-80%。它是Graves病（Graves’s disease，GD）的主要甲狀腺外表現，約20%-50%的GD患者受累。由于對其潛在免疫畸變的了解有限，因此開發(fā)有效的治療方法受到限制。
實驗材料
采用scRNA-seq和單細胞BCR測序 (scBCR-seq) 技術來研究具有活性TAO、不活性TAO和NC的個體之間細胞組成和BCR庫的變化。
1、scRNA-seq、scBCR-seq
使用來自6名TAO患者和3名NC的血液樣本進行scRNA-seq和scBCR-seq。
2、流式細胞術
15名非活動性TAO患者、7名活動性TAO患者和10名NC用于流式細胞術分析。
研究結果
1.TAO患者外周免疫細胞的單細胞轉錄譜
為了了解疾病不同階段單細胞轉錄組的異質性，該研究根據CAS標準將TAO患者分為兩組：眼眶炎癥明顯的為活動組，臨床癥狀輕微的為非活動組。從每位受試者的全血中分離出PBMC以供進一步研究。
該研究使用10x Genomics Chromium平臺對總共9個樣本進行了scRNA-seq。經過初步質量控制后，總共獲得了93,007個PBMC用于后續(xù)分析，其中包括來自活性TAO的23,051個細胞、來自非活性TAO的34797個細胞和來自正常對照 (NC) 的35,159個細胞?；趫D的聚類分析確定了17個不同的聚類。在手動確認細胞類型注釋后，該研究成功將簇分為五種主要的PBMC細胞類型。其中包括各種CD4+ T細胞群 (CD4+)、NK (CD56+)、CD8+T細胞 (CD8A+)、B細胞 (CD19+) 和骨髓細胞 (CD11b+)（圖1A，1B）。通過流式細胞術分析驗證了scRNA-seq鑒定的這五種細胞類型的存在（圖1C）。值得注意的是，17個細胞簇中的12個 (70.6%) 包含來自多個單獨樣本的至少100個細胞，每個簇內平均有9個單獨樣本。
接下來，該研究試圖根據疾病階段檢查這些人群的患病率變化。作者計算了通過 scRNA分析識別的每個簇相對于每個患者樣本的簇總數的百分比（圖1D）。研究結果顯示，患者的免疫特征存在顯著差異，活性TAO顯示顯著的B細胞浸潤 (p=0.047) 和骨髓細胞浸潤 (p=0.008) 。相比之下，NK細胞主要在非活性TAO (p=0.022) 和 NC (p=0.059) 中觀察到。盡管差異未達到統(tǒng)計學顯著性，但非活性TAO和NC樣本均顯示出CD4+T細胞的富集。CD8+T細胞的比例在這些樣本組中表現出最小的變化。這些發(fā)現強調了活躍TAO個體中PBMC組成的變化，強調了深入了解細胞亞型多樣性和與疾病階段相關的狀態(tài)的重要性。
圖1-TAO患者外周免疫細胞的單細胞轉錄譜
2.調節(jié)性B細胞參與TAO期間的免疫調節(jié)
為了全面了解B細胞的異質性及其在TAO中的作用，該研究基于RNA-seq數據進行了進一步分析，以確定其不同的亞群。使用基于圖的聚類，該研究確定了五個亞群，總共包含9493個B 細胞（圖2A）。此外，該研究徹底評估了與B細胞譜系相關的一組綜合基因的表達，以更深入地了解它們的獨特特征。濾泡B細胞的特征是表達IGHD(IgD)和CD23（也稱為FCER2）。邊緣區(qū)B群體表現出JCHAIN(IgM) 和CD21的高表達。Bregs根據CD1d、CD5、CD19、CD24、CD38和CD27的表達進行鑒定。此外，生發(fā)中心B細胞被認為是顯示高水平CD20 (MS4A1)、CD38?和FCRL3的簇。最后，少量B細胞被鑒定為多淋巴祖細胞，表達CD45RA (PTPRC)、CD34和CD10(MME)（圖2B）。每個B細胞亞群的前10個不同表達基因 (DEG) 為該研究的注釋提供了額外的證據，并支持每個 B 細胞亞群的獨特身份和功能特征。
隨后檢查了疾病不同階段每個樣本中的B細胞組成。雖然三組的Bregs相對比例沒有顯著差異，但與非活動TAO組和正常對照組相比，活動TAO中的Bregs比例較低（p=0.078和p=0.065）（圖2D）。盡管觀察到的差異未達到統(tǒng)計顯著性，但這一結果表明了數據的潛在趨勢。為了驗證這些結果，該研究進行了流式細胞術分析，并使用CD19+IL-10+作為識別Bregs細胞群的標記。IL-10由于其抑制促炎癥反應的能力而被廣泛認為是Breg的標志。該分析證實，與非活動TAO和NC組相比，活動TAO中的Breg頻率降低（圖2E）。
進行軌跡分析以闡明不同B細胞亞群之間的動態(tài)關系。分析發(fā)現了3個分支點和5 個不同的狀態(tài)。狀態(tài)1的特征是邊緣區(qū)B細胞和FCRL3高GC B細胞同時分布。狀態(tài) 2由一小部分濾泡B細胞組成。狀態(tài)3主要由濾泡B細胞組成。狀態(tài)4和狀態(tài)5主要由 Breg組成。此外，所有狀態(tài)都表現出彌散的多淋巴細胞祖細胞（圖2F）。與之前的發(fā)現一致，該研究觀察到活性TAO中處于狀態(tài)4和狀態(tài)5的Bregs細胞密度降低。根據SCENIC分析，發(fā)現一組受不同轉錄因子調控的獨特基因在Bregs中特異性表達，而在其他細胞類型中幾乎不存在（圖2G）。在Bregs中，受RORA、CEBPD、PRDM1、FOSL2和EOMES調控的基因顯示出明顯更高的表達水平。
GO富集分析顯示，Bregs表現出與免疫調節(jié)（AIF1、CSK、HLA-DRB5、CYBA）、細胞周期進程、信號轉導和細胞凋亡相關的上調基因（ARPC1B、CORO1A、YWHAB），（RHOA，CLIC1，S100A6，NME2）（圖2H，2I）。值得注意的是，在活躍的TAO中，Bregs上調的基因在炎癥相關的GO術語和細胞過程相關的GO術語中豐富。這些發(fā)現強烈表明Bregs可能在TAO過程中調節(jié)炎癥和免疫反應中發(fā)揮關鍵作用。根據CellPhoneDB分析，Bregs表現出與骨髓細胞的高頻率通信（圖2J）。這一發(fā)現表明Breg和骨髓細胞可能在TAO期間參與協(xié)調的免疫調節(jié)過程。
圖2-調節(jié)性B細胞參與TAO期間的免疫調節(jié)
3.scBCR-seq分析發(fā)現活性TAO中BCR多樣性顯著增加
為了全面分析B細胞群中的基因表達和BCR多樣性，該研究對scRNA-seq分析中使用的PBMC樣本進行了scBCR-seq。在活性TAO中，前10個克隆型的比例（0.17%）與非活性組（0.37%，p=0.010）和NC組（0.41%，p=9.31E-05）（圖3A）。然而，對互補決定區(qū)3 (CDR3) 長度的分析沒有顯示任何明顯的變化（圖3B）。當檢查CDR3的多樣性時，通過Chao1指數量化，與NC組 (p=0.016) 和非活動TAO組 (p=0.002) (圖3C)。Breg細胞中也出現了類似的趨勢（圖 3D），與NC組相比顯著增加（p=0.011），但活性TAO之間沒有統(tǒng)計學顯著差異組和NC組 (p=0.213)。這些發(fā)現表明，雖然活性TAO中前10個克隆型的頻率降低，但在這種情況下CDR3序列的多樣性增加，這可能對免疫反應的調節(jié)有影響，并有助于活性TAO的發(fā)病機制。
圖3-scBCR-seq分析發(fā)現活性TAO中BCR多樣性顯著增加
4.活性TAO中骨髓細胞結構的改變
為了評估骨髓細胞在TAO中的參與情況，該研究鑒定了骨髓細胞的主要亞型，并檢查了它們在活性TAO中的配置。分析顯示了五種不同的骨髓細胞群，即單核細胞、巨核細胞、樹突狀細胞 (DC)、單核細胞衍生的DC和紅細胞（圖4A ）。這些細胞類型的鑒定基于差異基因表達和對已建立的譜系標記的檢查（圖4B）?；钚訲AO 和非活性TAO之間的比較揭示了單核細胞和DC比例的顯著差異。與非活動TAO組相比，活動TAO患者的單核細胞比例顯著較高 (p=0.006)，而活動TAO中DC的比例顯著較低 (p= 0.003) (圖4C)。這些發(fā)現表明，單核細胞水平增加和DC數量減少可能是TAO患者活動性疾病狀態(tài)的特征。
圖4-活性TAO中骨髓細胞結構的改變
5.DCs可能參與TAO活躍期間的炎癥過程
DC被細分為三個不同的子簇。Cluster 0被指定為cDC1s，其特征是高表達CDKN1C、FCGR3A、SMIM25、IFITM3、LST1和MS4A7，以及CD1C和 CD141的低表達。簇1和簇2被鑒定為cDC2，其炎癥基因的表達水平升高，例如 CD14、S100A8、GNLY、NKG7 、IL32和S100A12（圖5A、5B）。cDC1s的比例在活性TAO中顯著較高，而cDC2s在非活性TAO和NC中更為普遍（圖 5C）。鑒于cDC1和cDC2在免疫調節(jié)中發(fā)揮不同的作用- cDC1專門誘導Th2反應，而cDC2亞群表現出更強大的誘導Th1反應的能力[42]，該研究進一步檢查了它們的基因表達譜。
關于cDC1，與MHC II抗原呈遞（HLA-DRB5、IFI30）、免疫激活（NAPSB）以及發(fā)育和神經遺傳相關的基因與NC相比，疾病 (NBPF14) 在活性TAO中高度表達（圖5D、5E）。對于cDC2，與NC相比，在活性TAO中觀察到更高水平的 HLA-DRB5和FCN1（圖5D，5E）。富集分析表明，對于兩種DC，活性TAO中上調的基因主要與炎癥、免疫激活途徑和補體激活途徑相關的各種過程相關（圖 5F）。這些結果表明，在活躍的TAO中，DC的活化可能受到損害，并且在此活躍階段觀察到的炎癥可能與這些細胞密切相關。
圖5-DCs可能參與TAO活躍期間的炎癥過程
6.單核細胞通過調節(jié)炎癥細胞因子的產生在活性TAO中發(fā)揮作用
作者的聚類分析成功地從總共 12,959 個單核細胞中識別出三個不同的亞群。第一個簇的特征是經典單核細胞 (CMO)，其表現出高表達水平的CD14、S100A8 和 S100A9。第二個簇被鑒定為非經典單核細胞 (NMO)，其特征是高表達FCGR3A（也稱為 CD16）。第三簇被識別為中間單核細胞 (IMO)，CD14和FCGR3A均高表達（圖6A、6B）。為了驗證這些單核細胞亞簇，進行了流式細胞術分析，確認 CMO為CD14++CD16-，NMO為CD14+CD16++，IMO為CD14++CD16+（圖6C）。軌跡推斷分析表明，單核細胞遵循從CMO開始并向NMO和IMO狀態(tài)分支的發(fā)育軌跡（圖6B）。這些對TAO期間單核細胞發(fā)育狀態(tài)變化的觀察表明它們在該疾病中的潛在作用。
圖6-單核細胞通過調節(jié)炎癥細胞因子的產生在活性TAO中發(fā)揮作用
7.TAO中Breg細胞和骨髓細胞之間的串擾
進一步檢查了活躍TAO背景下Breg、DC和單核細胞之間的細胞相互作用。該分析總共確定了1,352對重要的相互作用。值得注意的是，Bregs被發(fā)現表現出最多數量的配體，而cDC1亞簇則表現出最多數量的受體。值得注意的是，與非活性TAO 和正常對照組(NC)相比，Bregs在活性TAO中顯示出配體數量增加（圖7A）。
該研究對與炎癥和免疫激活相關的相應受體和配體的表達模式進行了詳細分析。與非活動性TAO組和正常對照(NC)組相比，活動性TAO患者中Breg與cDC1、cDC2、IMO、NMO或CMO之間的CD22-PTPRC相互作用明顯更強（圖7B）。此外，該研究觀察到活性TAO中存在強大的抑制相互作用，例如Bregs和cDC1、cDC2或IMO之間的BTLA-TNFRSF14。這一發(fā)現表明，在TAO活躍的情況下，Bregs可能發(fā)揮更大的免疫抑制作用（圖7B）。
通過檢查在免疫抑制和炎癥過程中具有潛在作用的基因的表達水平，研究發(fā)現活躍 TAO期間Breg中的CD22、PTPRC、BTLA和TNFRSF14增高。此外，與非活性TAO和正常對照(NC)組相比，活性TAO中的Breg、DC和單核細胞中BTLA和 TNFRSF14的表達水平總體增加（圖 7C）。這些發(fā)現表明，在活躍的TAO過程中，Breg、DC和單核細胞之間存在復雜的調節(jié)相互作用，這可能有助于在疾病中觀察到的炎癥和免疫反應。
圖7-TAO中Breg細胞和骨髓細胞之間的串擾
研究總結
該研究強調了具有活性TAO、非活性TAO和NC的個體中B細胞、DC和單核細胞的比例和轉錄異質性的顯著變化。這些發(fā)現為了解活躍TAO期間外周免疫環(huán)境中免疫細胞浸潤的變化提供了寶貴的見解。
值得注意的是，該研究發(fā)現了兩個配體-受體對CD22-PTPRC和BTLA-TNFRSF14的潛在抑制作用，這可能有助于減少Bregs 并削弱活性TAO中炎癥的抑制作用。這些潛在的致病細胞和分子可能是TAO炎癥變化的原因，因此可能被確定為該疾病的新治療靶點。
此外，該研究描述了TAO中BCR庫的免疫特征，揭示了活躍TAO期間BCR多樣性的顯著增加。該研究揭示了活性TAO中觀察到的炎癥反應的分子和細胞基礎。通過更好地了解這種情況下的免疫失調，該研究為未來開發(fā)更有效的免疫治療策略奠定了基礎。隨著對潛在機制的進一步驗證和探索，這些發(fā)現有可能為TAO患者的靶向和個性化治療做出重大貢獻。
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文章標題：Acetyl-CoA metabolism maintains histone acetylation for syncytialization of human placental trophoblast stem cells
期刊名稱：Cell Stem Cell
影響因子：19.8
合作單位：中國科學院動物研究所
研究對象：人類妊娠早期胎盤樣本和人類滋養(yǎng)層干細胞(hTSCs)
研究方法：轉錄組、表觀組學和非靶向代謝組學等
百邁客生物為該研究提供了轉錄組和非靶向代謝組檢測和分析服務。
研究背景
在妊娠期間，胎盤是連接母體和胎兒的重要瞬時器官，不斷向胎兒輸送氧氣、營養(yǎng)物質和代謝物，維持胎兒的正常生長發(fā)育。胎盤發(fā)育是一個復雜的過程，包括胚泡期單層胚滋養(yǎng)外胚層(TE)向致密、多核、多細胞和多層器官的轉變。在懷孕期間，胎盤和胎兒的營養(yǎng)分配對胎兒和母親的健康至關重要。然而，胎盤滋養(yǎng)細胞中營養(yǎng)物質代謝和分配的調控機制尚不清楚。
實驗材料
從北京大學第三醫(yī)院(中國北京)治療性終止健康妊娠的6-8周的人正常絨毛組織收集。術后1小時內，將組織浸泡在冰凍的DMEM/F12培養(yǎng)基中，進行原代細胞分離或組織固定。從新鮮人絨毛組織中分離到原代滋養(yǎng)細胞(CTBs和STBs)。將人絨毛組織倒搖3分鐘，通過100mm和38mm篩子，收集38mm篩子上殘留的STB。將殘留在100毫米屏幕上的絨毛組織浸泡在PBS中，修剪成2-3毫米的組織。然后，用0.25%的胰蛋白酶和DNase消化絨毛組織，在4℃，并通過75毫米篩子。離心收集細胞，在1.25%和2.5%牛血清白蛋白(BSA)中沉淀得到細胞滋養(yǎng)層細胞。
研究結果
1.組織學分析——糖酵解酶水平在合胞滋養(yǎng)細胞中顯著降低
妊娠期間，STB是一種重要的胎盤滋養(yǎng)細胞，可介導代謝物交換，分泌多種激素，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮等。為了研究滋養(yǎng)細胞合胞過程中原代CTBs和STBs之間發(fā)生的代謝變化，該研究挖掘了之前人類妊娠早期胎盤的單細胞RNA測序(RNA-seq)數據。結果發(fā)現，在RNA水平上，原代CTBs中糖代謝和TCA循環(huán)的多個關鍵酶的表達高于STB。
通過免疫組織化學和免疫熒光染色在孕早期人類胎盤絨毛組織中，證實了許多關鍵的糖酵解酶，包括己糖激酶2 (HK2)、磷酸果糖激酶、血小板型(PFKP)、磷酸果糖激酶、肝型(PFKL)和乳酸脫氫酶A (LDHA)，確實在CTBs中比體內STBs更廣泛地表達(圖1A)。通過實時qPCR和免疫印跡(圖1B)繪制關鍵代謝酶的變化。結果顯示，糖酵解酶，包括己糖激酶1 (HK1)、HK2、PFKP、PFKL、丙酮酸激酶M1 (PKM1)、LDHA和乳酸脫氫酶B (LDHB)， CTBs均顯著高于STBs(圖1B和1C)。線粒體生物發(fā)生相關轉錄因子PGC1a和細胞色素氧化酶(COX) IV在STBs中高表達，而糖原代謝酶肝糖原磷酸化酶(PYGL)和糖原1 (GYG1)在CTBs中高于STBs(圖1C)，與糖原的周期性酸-希夫(PAS)染色一致(圖1A)。在主要調控糖酵解酶的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路中，CTBs中蛋白激酶B (AKT)、核糖體蛋白S6 (S6)和真核翻譯起始因子4E (4EBP1)的磷酸化水平顯著高于STBs(圖1C左)。這些結果表明，糖酵解和糖原溶解的糖代謝途徑在合胞滋養(yǎng)細胞中顯著減少，而OxPhos水平基本保持不變。
圖1-人類原始CTBs和STBs的代謝狀態(tài)
2.代謝組學分析——滋養(yǎng)細胞合胞化伴隨著代謝的重構
為了更詳細地驗證CTBs和STBs之間的代謝差異，對妊娠早期胎盤中的原代CTBs和STBs進行了代謝組學分析(圖2A)。相關熱圖、主成分分析(PCA)圖和代謝物豐度熱圖顯示，CTBs和STBs之間的代謝物存在顯著差異。CTBs中葡萄糖代謝相關代謝物豐度高，包括3-磷酸甘油酸(3-PG)、乳酸、丙酮酸、蘋果酸、a-酮戊二酸等。STBs中富含脂肪酸代謝和激素代謝相關產物，包括雌酮、膽固醇、亞油酸等(圖2B)。CTBs和STBs的前20位代謝物也有顯著差異。代謝物MSEA集富集分析(圖2C)和KEGG代謝物分析顯示CTBs主要富集于葡萄糖代謝和氨基酸代謝，包括Warburg效應、色氨酸、甘氨酸和絲氨酸代謝、糖酵解等。相比之下，STBs主要富集脂肪酸代謝和類固醇激素合成相關通路，包括α -亞麻酸和亞油酸代謝、雌酮代謝、花生四烯酸代謝、類固醇生物合成等。
此外，將代謝組學結果與葡萄糖代謝的蛋白質分析結果聯合分析(圖2D)。結果表明，CTBs和STBs代謝產物的變化與代謝酶蛋白的變化一致。CTBs的糖酵解代謝物、3-PG、丙酮酸和乳酸明顯高于STBs(圖2D)。CTBs中TCA循環(huán)中的檸檬酸、α-酮戊二酸和蘋果酸明顯高于STBs(圖2D)。相比之下，STBs體內類固醇激素代謝的相關關鍵代謝物較高，這與STBs合成激素的特點相一致。綜上所述，CTBs和STBs之間的代謝程序存在明顯差異。在高度增殖和未分化的CTBs中，葡萄糖代謝和氨基酸代謝更為活躍，而在有絲分裂后和分化的STBs中，脂肪酸代謝和類固醇激素代謝更為活躍。
圖2-人原代CTBs和STBs的非靶向代謝組學分析
3.代謝組分析——葡萄糖代謝的基礎水平是滋養(yǎng)細胞合胞的必要條件
根據代謝組學和蛋白組學分析結果，葡萄糖代謝水平在合胞后急劇下降到基礎水平。許多研究表明，葡萄糖代謝的變化對決定干細胞的命運和分化很重要，因此，研究推測糖代謝與滋養(yǎng)細胞合胞之間存在重要聯系。為了在體外微擾實驗中模擬滋養(yǎng)細胞的合胞過程，該研究使用了hTSC培養(yǎng)和融合分化系統(tǒng)。再次檢測hTSCs在中誘導合胞前和合胞過程中相關代謝酶的蛋白和RNA水平。糖酵解的結論與原代CTBs和STBs的結果基本一致。
為了探索葡萄糖代謝對滋養(yǎng)細胞合胞過程的功能影響，該研究分別在未分化的hTSCs(在滋養(yǎng)細胞干細胞(TS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，TS- d4)和分化的STB(在STB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，STB- d4)中使用HK抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-DG)和LDH抑制劑oxamate抑制糖酵解的上游和下游速率限制步驟(圖3A)。由于糖代謝降低與STB分化相關(圖1、2)，研究者最初假設糖酵解抑制應該促進合胞化。但是結果發(fā)現，與未分化的hTSCs相比，僅保留基礎糖酵解水平的合胞hTSCs對糖酵解的減少比較敏感。
圖3-基礎糖酵解對于人類TSCs的合胞轉化至關重要
4.代謝組分析——糖酵解代謝產物的較佳水平促進滋養(yǎng)細胞合胞
接下來，該研究使用糖酵解的關鍵代謝物，包括葡萄糖、丙酮酸和醋酸酯(用于補充細胞內乙酰輔酶A)，來探索糖酵解代謝物對人滋養(yǎng)細胞合胞的影響。結果表明，隨著葡萄糖濃度的增加，從5到18 mM，STB-D4細胞中HCGB以及SDC1、ERVFRD1、ERVW1、GCM1、PSG4和CYP19A1的表達逐漸增強，滋養(yǎng)細胞的合胞化程度逐漸增強(圖3D)。丙酮酸處理在未分化的hTSCs和正在合胞的hTSCs中導致了類似的反應，即一定濃度范圍內（10 mM）的代謝物增加了滋養(yǎng)細胞的合胞 (圖3E)。同樣，在一定濃度范圍內，乙酸也顯著促進滋養(yǎng)細胞合胞(圖3F)，在超高濃度下，HCGB、GCM1、PSG4和CYP19A1被顯著抑制(圖3)。特別指出，糖酵解藥物和中間體對HTSCs和STBs的合胞有特異性作用，但對未分化的htsc沒有特異性作用。因此，涉及STB特異性信號傳導，并且調節(jié)滋養(yǎng)層合胞化可能需要較佳水平的基礎糖酵解物質。
圖4-糖酵解乙酰輔酶A是TSCs合胞所需的關鍵代謝物
5.代謝組分析——乙?；拇x調節(jié)對合胞作用至關重要
實驗表明，糖酵解產物顯著抑制hTSCs的合胞，而最佳水平的乙酸促進hTSCs的合胞。為了反向確定最關鍵的糖酵解代謝物，該研究探索了最下游的糖酵解代謝物乙酰輔酶A(由乙酸補充)是否可以挽救糖酵解抑制對合胞的影響。結果顯示，在糖酵解抑制的情況下，乙酸能顯著恢復STB-D4中HCGB和SDC1的表達水平(圖4A-4C)。融合指數結果證實了合胞恢復以劑量依賴的方式(圖4D和4E)。然而，當乙酸濃度過度增加到50 mM時，STBs細胞形態(tài)發(fā)生異常，引發(fā)細胞死亡，HCGB和SDC1基因表達無法檢測(圖4A)。因此使用10mM醋酸鹽用于所有其他實驗。實驗顯示，低濃度20 mM的草酸鹽對活死染色、線粒體膜電位、總蛋白、ADP/ATP比率和NAD+/NADH比率的影響不顯著或輕微，但通過靶向LC-MS/MS檢測，乙酰輔酶A顯著降低。10 mM醋酸鹽可使其乙酰輔酶A水平恢復正常。這些結果表明，乙酰輔酶A可能對滋養(yǎng)細胞的合胞作用很重要。
有報道稱，由于乙酰轉移酶具有較高的Km，細胞內乙酰輔酶a可以作為蛋白質乙?；牡孜锊⒅苯诱{控蛋白質乙?；?，從而直接影響細胞的命運。例如，組蛋白乙?；拇x調節(jié)對染色質狀態(tài)轉變至關重要。為了廣泛調查蛋白質乙?；淖兓?，該研究對乙酰賴氨酸進行了免疫印跡特異性檢測。結果顯示，未分化hTSCs的乙酰賴氨酸水平對草酸鹽相對不敏感，對乙酸補充也不敏感，除了在- 55 kDa處可能代表乙酰微管蛋白的條帶(圖4F、4G)。相反，分化STBs的乙酰賴氨酸水平被草酸鹽顯著降低，并被乙酸鹽顯著恢復(圖4F和4G)。特別是，組蛋白(H3和H4, 10-15 kDa)乙酰化對乙酸表現出明顯的劑量依賴性反應。因此，該研究檢測了乙酸鹽和草酸鹽處理的TS-D4和STB-D4細胞中乙?；? h3和乙?；? h4k16的水平。結果顯示，草酸鹽對未分化hTSCs中H3和H4K16的乙?；接绊懖淮螅@著抑制STB-D4中H3和H4K16的乙酰化水平(圖4H、4I)。在草酸處理的細胞中分別添加5和10 mM乙酸時，H4K16乙酰化水平在劑量依賴性反應中表現出最大的梯度，而H3乙?；?，包括H3K9/18/27乙?；?，在劑量依賴性反應中表現出較平緩的梯度(圖4H、4I和SGM – s5p)。
綜上所述，該研究表明，適當的乙酸濃度可以緩解糖酵解抑制對合胞的抑制。草酸鹽的糖酵解抑制降低了STBs糖酵解乙酰輔酶A的基礎產生，從而降低了滋養(yǎng)細胞合胞過程中組蛋白乙?；乃?。因此，適當補充乙酸可以恢復細胞內乙酰輔酶A的水平，從而恢復正常的蛋白質乙酰化，特別是組蛋白H3和H4乙?；⒒謴驼５淖甜B(yǎng)細胞合胞(圖4J)。因此，糖酵解乙酰輔酶A的基礎水平對于調節(jié)組蛋白乙?；蚳TSC合胞是至關重要的。
圖5-RNA-seq顯示糖酵解衍生的乙酰輔酶A是促進滋養(yǎng)細胞合胞程序所必需的，在合胞過程中，低水平的糖酵解衍生的乙酰輔酶A會觸發(fā)滋養(yǎng)細胞的代謝和炎癥應激反應
6.轉錄組分析——RNA-seq顯示糖酵解乙酰輔酶A代謝是促進滋養(yǎng)細胞合胞程序所必需的
為了進一步表征乙酸如何在滋養(yǎng)細胞合胞過程中恢復糖酵解抑制的作用，作者對經草酸和乙酸處理的TS-D4和STB-D4細胞進行了RNA測序(N = 8個樣本)。相關熱圖分析和主成分分析顯示，經草酸和乙酸處理的未分化hTSCs的基因表達變化無明顯變化(圖5A)。然而，對于正常的STB-D4 (STB_c)，草酸處理(STB_ox)導致轉錄組發(fā)生劇烈變化，而5和10 mM乙酸處理(STB_oa5, STB_oa10)逐漸使轉錄組恢復正常(圖5A)?；蚣患治?GSEA)進一步證實未分化的hTSCs被富集用于糖酵解，而分化的STBs則被富集用于類固醇激素基因(圖5B)。這些轉錄組結果再次強調了未分化的hTSCs對草酸或乙酸鹽不敏感，而分化的STBs對草酸抑制和乙酸鹽拯救高度敏感。
根據翻轉圖(圖5C)，被草酸 (STB_ox)特異性下調但被乙酸(STB_oa5或STB_oa10)逆轉的基因表現出強烈的劑量依賴性。合胞化相關基因，包括SDC1、CGB同源物、ERVW1、ERVFRD1和GCM1，在草酸抑制的STB-D4中以劑量依賴的方式被5和10 mM乙酸部分恢復(圖5D)。
火山圖顯示，在STB_ox中，CGB同源基因、ERVFRD1、ERVW1、SDC1、CYP17A1等合胞程序基因顯著降低，而JUN、腫瘤壞死因子(TNF)、FAS、TP53等炎癥相關基因顯著上調。相反，補充乙酸導致SDC1、CGB同源物、ESRRB、CYP17A1、PSG11等合胞程序基因上調，表明STBs功能逐漸恢復。
接下來，研究者使用短時間序列表達挖掘(STEM)技術分析具有相同趨勢的基因簇。圖中顯示了胎盤cAMP信號、激素代謝和ERK/MAPK通路中一些已知的基因(圖5E)。
此外，GSEA進一步顯示，與未分化的HTSC (TS_c)相比，STB_c中特異性富集了糖皮質激素、激素生物合成、抗菌肽和胺源性激素等四個基因集(圖5F)。此外，與單獨處理STB_ox的STB_c和STB_d4 (STB_oa5和STB_oa10)相比，這四個基因組在同時處理的STB_c和STB_d4中也顯著富集。
綜上所述，這些結果表明糖酵解衍生的乙酰輔酶A對于滋養(yǎng)細胞合胞程序和STB核心功能的適當激活是必要的。與hTSC程序相比，研究發(fā)現整個STBs分化程序對糖酵解乙酰輔酶A代謝異常敏感。
7.轉錄組分析——滋養(yǎng)細胞感知葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的缺乏，從而在合胞過程中觸發(fā)代謝和炎癥應激反應
該研究將被乙酸拯救并下調的基因定義為“下調”。該集合包括三個集群，U17(145個基因)、U20(614個基因)和U18(288個基因)。這些基因都與細胞損傷和炎癥應激反應有關。其中許多是眾所周知的抗氧化、自噬、線粒體、DNA損傷和NF-kB特征中的基因(圖5G)。
GSEA進一步顯示，與STB_c相比，未分化的TS_c特異性地富集了hippop – yap /Taz-TEAD特征(圖5H)。這些結果表明，草酸阻斷了STB的合胞，而這種分化阻斷被乙酸修復。此外，與正常STB_c和經草酸和乙酸(STB_oa5和STB_oa10)處理的STB-D4相比，涉及DNA損傷、白素-6 (IL-6)信號、炎癥反應和TNF信號的四種GSEA特征均在STB_ox中特異性富集(圖5I)。
綜上所述，在滋養(yǎng)細胞合胞過程中，葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的基礎水平是防止代謝應激和炎癥應激反應所必需的。研究發(fā)現STBs在分化和合胞過程中對糖酵解乙酰輔酶A應激高度敏感，并引發(fā)炎癥反應。
8.表觀組分析——組蛋白H3K9/18/27和H4K16乙?；瘜ζ咸烟堑囊阴；{控敏感，直接調控合胞化和代謝基因
鑒于滋養(yǎng)細胞可以感知葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的缺乏，從而終止合胞程序并觸發(fā)代謝應激誘導的炎癥反應信號，研究者研究了組蛋白乙?；欠窨赡苁沁@種現象背后的機制之一。該研究使用靶下切割和標記(CUT&Tag)技術，對TSCs、STB-D1、STB-D4、STB-D4ox和STB-D4-oa10樣品和acetyl-H3K9、acetyl-H3K18、acetyl-H3K27和acetyl-H4K16抗體的數據顯示，這四種組蛋白乙?；揎椩诤习^程中表現出明顯的變化。
此外，對于每個組蛋白修飾，在TSCs, STB-D1和STB-D4的基因啟動子區(qū)域進行了Venn交叉分析。僅在STB組中發(fā)現的基因(TS組中沒有)被定義為STBUP，表明這些基因啟動子在合胞過程中具有相關的組蛋白乙酰化修飾(圖6A-6D)。同樣，對STB-D4、STB-D4-ox和STB-D4-oa10進行了Venn交叉分析。僅在STB-D4和STB-D4-oa10中發(fā)現的基因被定義為STBres，而在STB-D4-ox中沒有發(fā)現，這表明這些基因啟動子具有由糖酵解乙酰輔酶A代謝調節(jié)的組蛋白修飾(圖6A-6D)。所有四種組蛋白乙?；腟TBUP組的交集被定義為STBUP-all。同樣，所有四種組蛋白乙?；腟TBres基團的交集(圖6E)被定義為STBres-all。
為了研究STBUP-al中哪些基因對合胞至關重要，該研究交叉了STBUP-all和STBres-all數據集。確定了2834個基因位點，其中TSS上的這四個組蛋白乙?；稽c都被乙酸拯救并與合胞有關(圖6E)，包括眾所周知的合胞標記SDC1、CGB和ERVFRD1(圖6I)。重要的是，已知CGB參與激素合成/分泌，與TSCs和STB-D1相比，在STB-D4中，CGB在其TSS啟動子區(qū)域表現出顯著的乙酰- h3k27(圖6I)。GO和KEGG通路分析顯示，這些基因主要參與有絲分裂控制、合胞起始和STB功能，包括MAPK通路、cAMP通路、胎盤發(fā)育、激素合成/分泌、糖、氨基酸和脂肪酸運輸(圖6G、6J-6L)。其中，已知CYP19A1參與激素合成/分泌，在STB-D4的TSS啟動子區(qū)域顯示顯著的乙酰- h3k27(圖6J)。胎盤發(fā)育的另一個關鍵基因GCM1在STB-D1和STB-D4的TSS啟動子區(qū)域均顯示出顯著的乙酰- h3k9(圖6K)。cAMP應答元件結合蛋白1 (CREB1)參與“cAMP應答元件結合”，在STB-D1和STB-D4的TSS啟動子區(qū)域表現出顯著的乙酰- h4k16(圖6L)。重要的是，草酸處理明顯導致所有這些基因的TSS啟動子區(qū)域組蛋白乙?；@著降低，而乙酸補充部分恢復了組蛋白乙?；?/strong>(圖6I-6L)。
為了探究被乙酸拯救的組蛋白乙?；欠褚矊е罗D錄拯救，該研究比較了來自CUT&Tag的STBres-all集與來自RNA-seq的拯救基因集(包括U5、U7和U8，共660個基因)。分析結果顯示，這兩個基因集共有323個基因(圖6F)，即表觀遺傳和轉錄獲救。對這些表觀遺傳和轉錄獲救的基因進行GO和KEGG通路分析的結果與RNA-seq分析的結果相似，在cAMP和MAPK信號、激素合成/分泌以及其他合胞途徑中的跨膜物質運輸中都有顯著的富集(圖6H、6M、6N)。
值得注意的是，在“活性跨膜轉運體活性”途徑中，草酸處理后，SLC30A3在其TSS啟動子區(qū)域乙?；鵫3k18顯著降低，而乙酸補充能夠部分恢復其乙?；鵫3k18(圖6M)。在“類固醇激素應答”途徑中，經草酸鹽處理后，ESRRB在其TSS啟動子區(qū)域乙酰h4k16顯著降低，部分被醋酸鹽挽救(圖6N)。
綜上所述，由乙酰輔酶A調節(jié)的組蛋白乙?；瘜τ谧甜B(yǎng)細胞合胞程序和STB核心功能的適當激活是必要的。與TS細胞對草酸和乙酸不敏感相比，研究發(fā)現STB分化程序對乙酰輔酶A代謝異常敏感。
圖6-乙酰基- h3k9、乙?；? h3k18、乙?；? h3k27和乙酰基- h4k16在TSC合胞過程中的動態(tài)變化
9.轉錄組和表觀組分析——體內短暫的糖酵解乙酰輔酶a缺乏會永久性地損害滋養(yǎng)細胞的合胞作用
人TSCs可以注射到免疫缺陷的NOD-SCID小鼠體內，以評估其體內分化潛力。因此，該研究使用這種異種移植模型來探索糖酵解乙酰輔酶A短暫缺乏對人滋養(yǎng)細胞體內合胞的永久表觀遺傳影響。
小鼠皮下注射對照hTSCs (TS-ctrl)、氨基甲酸酯處理hTSCs (TS-ox)和氨基甲酸酯和醋酸酯短暫處理hTSCs (TS-oa10)。隨意喂養(yǎng)NOD-SCID小鼠生長7天后，檢測血清hCG，并對移植的滋養(yǎng)細胞進行免疫熒光和免疫組織化學染色，以確定體內滋養(yǎng)細胞的合胞程度(圖7A)。然而，結果顯示STBs分泌到TS-ox小鼠血清中的hCG明顯低于TS – control小鼠(圖7B)。這與靶向數據一致，顯示在STB分化的第1天，乙酰輔酶A已經開始上升，轉錄和表觀基因組數據顯示，STB分化的許多標記已經在第1天開始上升。因此，滋養(yǎng)層細胞在分化24小時內就已經進入了STB的命運，在滋養(yǎng)層分化的這個時間點干擾糖酵解代謝可能對細胞命運產生不可逆的影響，但不影響細胞活力。
為了證明這一點，該研究對每個滋養(yǎng)細胞移植物進行組織染色。用KRT7和CDH1鑒定滋養(yǎng)細胞，用SDC1和b-hCG鑒定哪些細胞是STB。結果顯示，TS- control小鼠的滋養(yǎng)細胞移植物在體內能夠正常分化并形成多核STB(圖7C、7D)。然而，TS-ox小鼠體內形成的多核STB較少，盡管草酸處理的細胞仍然可以存活并在免疫缺陷小鼠中生長形成大的KRT7+/CDH1+移植物(圖7E, 7F)。
在TS-oa10小鼠中，多核STB的形成與TS – control小鼠相似，表明短暫的乙酸處理恢復了hTSCs的合胞能力(圖7G、7H)。此外，該研究計算了STB面積與移植物總面積的比值，結果表明，草酸處理的hTSCs在體內的合胞能力永久性降低。與TS -ox組相比，TS-oa10組經短暫乙酸處理后，體內STBs面積完全恢復(圖7I和7J)。同時，與TS-ox組相比，STBs向TS-oa10小鼠血清中分泌的hCG也顯著增加(圖7B)。
RNA-seq結果表明，糖酵解乙酰輔酶A缺乏引起體外STBs的促炎應激反應。因此，該研究檢查了它們在體內的炎癥狀態(tài)。結果顯示，與TS – control小鼠和TS-oa10小鼠相比，TS-ox小鼠滋養(yǎng)細胞移植物周圍有更多的自然殺傷細胞(NK)細胞(天然細胞毒性觸發(fā)受體1,NCR1)和巨噬細胞(F4/80, CD163)募集。這些結果表明，由短暫的糖酵解缺陷引起的異常的促炎滋養(yǎng)細胞命運可以通過醋酸處理永久地恢復。
鑒于人滋養(yǎng)細胞移植物在體內不再暴露于草酸或乙酸，研究結果表明，由表觀遺傳決定的STBs分化潛力可能會因糖酵解乙酰輔酶A代謝的短暫缺乏而永久中斷，由此產生的異常的促炎滋養(yǎng)細胞可以通過短暫的醋酸補充而在功能上得到恢復。
研究總結
該研究通過代謝組學、轉錄組學、蛋白組學和表觀組學等技術，使用人類妊娠早期胎盤樣本和人類滋養(yǎng)層干細胞(hTSCs)發(fā)現，葡萄糖代謝在hTSCs和細胞滋養(yǎng)層細胞中高度活躍，但在合胞過程中，葡萄糖代謝降低到基礎水平，仍然是補充乙酰輔酶A和分化潛力所必需的。補充乙酸可以通過補充乙酰輔酶A和維持組蛋白乙?；瘉硗炀忍墙徒馊狈Φ暮习甜B(yǎng)細胞融合，從而挽救合胞基因的激活。即使是短暫的糖酵解缺乏也會永久性地抑制分化潛能和促進炎癥，在體內也可以通過短暫補充乙酸永久地挽救。這些結果表明，hTSCs在合胞過程中僅保留基礎糖酵解乙酰輔酶A代謝，通過營養(yǎng)反應性組蛋白乙酰化調節(jié)細胞命運，這對我們理解胎盤和胎兒營養(yǎng)之間的平衡具有重要意義。
1. 當hTSCs和CTBs分化為STBs時，它們的糖酵解通量降低。
2. 分化的HTSC保留基礎糖酵解，對糖酵解缺乏變得敏感。
3. 分化的hTSCs通過組蛋白乙酰化在合胞過程中感知乙酰輔酶A。
4.短暫的糖酵解應激永久性地降低hTSCs的分化潛能。
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