1、材料和方法

材料：3只新西蘭母兔，分別取21日齡、49日齡、84日齡，7個(gè)不同部位的組織器官（腦、心臟、肺、肝、脾、腸竇、后腿骨骼肌），共21個(gè)樣本，分別提取RNA，等量RNA混合為單個(gè)樣品，分別進(jìn)行二代和三代測(cè)序。
測(cè)序策略：
二代測(cè)序：Illumina平臺(tái)、PE150測(cè)序；
三代測(cè)序：構(gòu)建0–1, 1–2, 2–3, 3–6 和5–10 kb五個(gè)文庫，PacBio RS II平臺(tái)測(cè)序，共測(cè)13個(gè)SMRT Cell
方法和思路：“3+2”測(cè)序模式，對(duì)混合的RNA進(jìn)行測(cè)序，獲得高可信度的轉(zhuǎn)錄本，完善參考基因組注釋，比較三代全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在旁系同源基因的還原上的優(yōu)勢(shì)，由此說明通過PacBio鑒定得到的轉(zhuǎn)錄本能夠更好的注釋基因以及還原基因結(jié)構(gòu)。

2、結(jié)果與分析

2.1三代測(cè)序和糾錯(cuò)
共獲得802,358個(gè)ROIs序列，其中有1.466,034全長非嵌合（FL）序列和316,000非全長（nFL）序列。
同時(shí)，二代測(cè)序獲得~120百萬clean reads，這些序列用來對(duì)三代的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，顯示總共135,178個(gè)序列（86.2%）被二代測(cè)序數(shù)據(jù)校正，錯(cuò)誤片段的長度比例相對(duì)較低（中位數(shù)8％）。

Figure 1.ROIs的分類和糾錯(cuò)

2.2 可變剪接和聚腺苷酸化
PacBio鑒定到多達(dá)24,797個(gè)AS事件，并對(duì)這些可變剪接進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)（Table 1），在兔的參考基因組中僅發(fā)現(xiàn)2,398個(gè)AS事件，將數(shù)據(jù)合并后共得到34,173個(gè)AS事件，且可變剪接事件包含不同的4中類型，另外，鑒定到11,184個(gè)APA事件。挑選5個(gè)基因，并用圖表示出不同的isoform比對(duì)到參考基因模型上（Figure 2）。

Table 1.可變剪接事件分析（IR：內(nèi)含子保留；ES：外顯子跳躍；Alt.5’：可變的5’端；Alt.3’：可變的）

Figure 2. 三代測(cè)得轉(zhuǎn)錄本的不同isoforms，在數(shù)據(jù)庫中的參考基因模型如圖示中被標(biāo)記有染色體位置、基因ID和基因名稱

2.3 與已知參考基因比對(duì)分析
通過對(duì)PacBio鑒定到的轉(zhuǎn)錄本的分析發(fā)現(xiàn)，有3,334個(gè)基因位點(diǎn)包含了3,637個(gè)轉(zhuǎn)錄本在參考基因中沒有注釋，并且有12,112個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋到參考基因的內(nèi)含子上，這些新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本大部分長度為1000~2000bp。

2.4 非編碼RNA分類
通過比對(duì)到參考蛋白數(shù)據(jù)庫，有30,183個(gè)轉(zhuǎn)錄本可編碼蛋白、6,003個(gè)轉(zhuǎn)錄本不能編碼蛋白，并且這些非編碼的轉(zhuǎn)錄本外顯子少、表達(dá)量低、且外顯子與內(nèi)含子在長度上的比值相較于可編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本略高（Figure 3）。對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類（Table 2）。
對(duì)非編碼轉(zhuǎn)錄本基因進(jìn)行分類，1,794個(gè)為基因間區(qū)、3,558個(gè)基因定位于可編碼轉(zhuǎn)錄本。

Figure 3.可編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄本比較

Table 2. 分類非編碼轉(zhuǎn)錄本（U：上游；D：下游；E：外顯子；I：內(nèi)含子）

2.5 旁系同源基因分析
選擇10個(gè)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）旁系同源基因，這些基因都被注釋在1.2-Mbp的12號(hào)染色體上（Figure 4）。結(jié)果顯示除了HLA-A之外，與參考基因組注釋相比，PacBio轉(zhuǎn)錄本的所有基因結(jié)構(gòu)都得到很好得恢復(fù)。 此外，PacBio數(shù)據(jù)還支持很多尚未注釋的轉(zhuǎn)錄本。所有的這些同源基因由于其轉(zhuǎn)錄本序列非常相似，很難通過二代組裝的方式都還原，而三代測(cè)序方式能夠很好地鑒定出旁系同源基因。

Figure 4.基因通過PacBio所測(cè)轉(zhuǎn)錄本和組裝得到的轉(zhuǎn)錄本還原10個(gè)MHC基因。染色體定位、命名和每個(gè)基因的Ensembl編號(hào)（在左側(cè)）。

如圖所示：從上到下排列依次為，Ensembl中的參考轉(zhuǎn)錄本（黑色），外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)通過一個(gè)個(gè)方框分開；PacBio transcripts(紅色)；Cufflinks(綠色)和Trinity(褐色)為組裝的轉(zhuǎn)錄本。

3、總結(jié)

二代測(cè)序由于短read組裝的困難，獲得全長轉(zhuǎn)錄本仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。在本研究中采用PacBio單分子長讀長測(cè)序技術(shù)，用于繪制兔的轉(zhuǎn)錄本圖譜。結(jié)果提供了一整套全面的轉(zhuǎn)錄本參考數(shù)據(jù)集，從而有助于改進(jìn)兔基因組的注釋。

參考文獻(xiàn)

Chen S Y, Deng F, Jia X, et al. A transcriptome atlas of rabbit revealed by PacBio single-molecule long-read sequencing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):7648.

研究背景

甘薯是許多發(fā)展中國家重要的作物之一，也是重要的能量來源。甘薯是同源六倍體植物，基因組大小約3-4G，目前還沒有高質(zhì)量的參考基因組。甘薯采用異花授粉的繁殖方式，自交不孕，導(dǎo)致基因組的雜合度高，目前還沒有關(guān)于甘薯正向遺傳學(xué)研究的報(bào)道。幾乎所有關(guān)于甘薯轉(zhuǎn)錄本的研究都是采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，沒有獲得大規(guī)模的全長cDNA序列，因此阻礙了甘薯功能基因組學(xué)和分子育種研究的進(jìn)展。長期以來，人們一直認(rèn)為甘薯有可能由二倍體祖先野生甘薯（I. trifida）進(jìn)化而來，但是沒有確鑿的證據(jù)。

研究目的

通過2+3聯(lián)合測(cè)序的方法獲得甘薯和野生甘薯的全長轉(zhuǎn)錄本，揭示二者的進(jìn)化關(guān)系。

材料方法

實(shí)驗(yàn)材料
甘薯和野生甘薯，不同組織（幼葉、成熟葉、莖尖、莖稈、須根、起始?jí)K根、膨大塊根和成熟塊根）分別等重量混合，提取RNA用于三代測(cè)序；同樣的材料用于二代測(cè)序。
測(cè)序方法及數(shù)據(jù)量
百邁客Pacbio RSII：構(gòu)建1-2k、2-3k、>3k的3個(gè)文庫，每個(gè)文庫分別測(cè)1個(gè)、2個(gè)、1個(gè)cell，共8個(gè)cell。
百邁客Illumina HiSeq 2500：甘薯和野生甘薯各測(cè)了17G和11G數(shù)據(jù)。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

5.1 全長轉(zhuǎn)錄本的統(tǒng)計(jì)及結(jié)構(gòu)注釋分析
統(tǒng)計(jì)三代的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：甘薯得到220,035 個(gè)ROI（reads of insert），其中全長非嵌合轉(zhuǎn)錄本（Full-Length Non-Chimeric, FLNC）占49.9％，非全長轉(zhuǎn)錄本（Non-Full-Length, NFL）占46.6％；野生甘薯得到195,188 個(gè)ROI，其中FLNC 和NFL 分別占52.1％和43.9％。對(duì)三代的數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正（自我糾錯(cuò)+二代數(shù)據(jù)矯正），甘薯和野生甘薯分別獲得了53,861和51,184個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本。此外，甘薯和野生甘薯分別預(yù)測(cè)到了104,540 和94,174 個(gè)ORF，全長轉(zhuǎn)錄本（同時(shí)含有5’-UTR，CDS和3’-UTR）分別有34,963和33,637個(gè)。甘薯和野生甘薯分別鑒定到了 25,315和 27,090 個(gè)SSR，以及471 和531 個(gè)lncRNA。

Figure 1. 對(duì)三代測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)和結(jié)構(gòu)注釋

5.2 甘薯、野生甘薯與其它植物的CDS比較分析
為了評(píng)估甘薯、野生甘薯的轉(zhuǎn)錄本和其他植物基因的相似性，我們比較了甘薯、野生甘薯與其他植物的開源CDS數(shù)據(jù)庫，包括紅苔藤、野生甘薯、牽牛花、煙草、馬鈴薯、大豆、擬南芥和水稻。結(jié)果表明甘薯和野生甘薯大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本都是同源的，說明這兩個(gè)物種擁有一個(gè)大致相同的基因庫。觀察高比例的轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)，盡管這些物種中的大量基因在進(jìn)化過程中存在著巨大的差異，但仍然共有一些短的motif，說明這些基因在進(jìn)化上顯示出高度的保守性。

Figure 2. 比較甘薯、野生甘薯和其他植物的轉(zhuǎn)錄本

5.3 全長轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)分析
三代測(cè)序得到的全長cDNA對(duì)于研究基因的結(jié)構(gòu)非常有用，例如分析外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。我們隨機(jī)挑選了50個(gè)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些基因含有的外顯子數(shù)目在甘薯、野生甘薯和擬南芥三個(gè)植物中的分布是相似的。

Figure 3. 分析甘薯、野生甘薯和擬南芥的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

5.4 甘薯和野生型甘薯的Ka/Ks分析
人們普遍認(rèn)為二倍體野生甘薯是六倍體作物甘薯的祖先，為了尋找參與甘薯進(jìn)化的候選基因，我們研究了甘薯和野生甘薯的基因選擇模式。首先比較了二者的完整轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)集，去除有多種同源性可能的那些轉(zhuǎn)錄本，確定了1269個(gè)假定的甘薯和野生甘薯之間的同源基因?qū)ΑｋS后，計(jì)算了每個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值，大多數(shù)基因?qū)Φ腒a/Ks比值都小于1，只有56個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值大于1，表明在甘薯的進(jìn)化或馴化過程中，大多數(shù)基因都是受到純化選擇的。而受到正向選擇的這些基因?qū)⒆鳛楹罄m(xù)研究的重點(diǎn)。

Figure 4. 分析甘薯和野生甘薯同源基因?qū)Φ腒a/Ks比值

創(chuàng)新點(diǎn)

1，對(duì)于無參或者參考基因組不好的物種，全長轉(zhuǎn)錄組可以獲得轉(zhuǎn)錄本全長序列，完善基因組注釋的信息。
2，通過全長比較轉(zhuǎn)錄組分析研究近源物種間的進(jìn)化關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：
Generation and comparative analysis of full-length transcriptomes in sweetpotato and its putative wild ancestor I. trifida（bioRxiv在線發(fā)表，2017）