英文名:Long Non-coding RNA Derived from lncRNA– mRNA Co-expression Networks Modulates the Locust Phase Change

期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics

IF：7.051（1區(qū)）

通訊作者單位：中科院、河北大學(xué)

研究背景

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)節(jié)基因表達(dá)、動(dòng)物行為等各種生物學(xué)過(guò)程。盡管蛋白質(zhì)編碼基因、microRNA和神經(jīng)肽在亞洲飛蝗的表型可塑性調(diào)節(jié)中起著重要作用，但有關(guān)lncRNA在此過(guò)程中功能研究較少。本文應(yīng)用高通量RNA-seq來(lái)比較蝗蟲(chóng)型變時(shí)程中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果顯示lncRNA在型變的早期階段反應(yīng)更快。功能注釋表明，早期改變的lncRNA在分散和群居階段采用了不同的途徑來(lái)應(yīng)對(duì)種群密度的變化。篩選了分散和群居階段的網(wǎng)絡(luò)中兩個(gè)重疊的中樞l(wèi)ncRNA基因座進(jìn)行功能驗(yàn)證。本文進(jìn)一步證明LNC1010057為潛在的蝗蟲(chóng)型變因子。這項(xiàng)工作為深入了解蝗蟲(chóng)型變的分子機(jī)制并擴(kuò)大lncRNA在動(dòng)物行為中的作用范圍提供了重要的數(shù)據(jù)。

材料方法

實(shí)驗(yàn)材料：散居化處理為將群居型蝗蟲(chóng)單獨(dú)飼養(yǎng)0h、4h、8h和16h后取出手機(jī)蝗蟲(chóng)大腦進(jìn)行測(cè)序；

群居化處理為將10只散居型蝗蟲(chóng)與20只群居型蝗蟲(chóng)飼養(yǎng)于一個(gè)小籠子（10厘米×10厘米×10厘米）中，于0h、4h、8h和16h后取出，收集蝗蟲(chóng)大腦進(jìn)行測(cè)序。在同一時(shí)間點(diǎn)采集樣品的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，提取RNA，建立cDNA文庫(kù)并進(jìn)行RNA-seq。對(duì)lncRNA和mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析及qRT-PCR驗(yàn)證，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行STEM(ShortTime-seriesExpressionMiner)分析，并構(gòu)建lncRNA–mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。對(duì)目標(biāo)中心節(jié)點(diǎn)lncRNA進(jìn)行RNAi，采集其行為錄像數(shù)據(jù)進(jìn)行行為數(shù)據(jù)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、蝗蟲(chóng)lncRNA的外顯子比mRNA少但更長(zhǎng)

研究發(fā)現(xiàn)大約78％的lncRNA包含2個(gè)外顯子，而mRNA中包含的外顯子數(shù)量為1至120（圖1C）。因此，lncRNA的外顯子明顯長(zhǎng)于mRNA的外顯子（平均長(zhǎng)度1142bpvs.263bp，圖1D，左）。同時(shí)，lncRNA的內(nèi)含子明顯短于mRNA的內(nèi)含子（平均長(zhǎng)度：10086bpvs.12442bp，圖1D，右）。表達(dá)水平分析表明，lncRNA的總體表達(dá)水平明顯低于mRNA的表達(dá)水平（平均值為0.6vs.1.9；圖1E）。但是，表達(dá)特異性分析表明，lncRNA的表達(dá)受時(shí)間限制的程度要高于mRNA（平均值為0.672對(duì)0.436圖1F）。基于相對(duì)于mRNA的lncRNA基因組位置，蝗蟲(chóng)lncRNA被分類(lèi)為基因間、重疊區(qū)、有義內(nèi)含子、反義內(nèi)含子、有義外顯子和反義外顯子?；认x(chóng)77％以上的lncRNA是長(zhǎng)基因間的ncRNA（lincRNA，圖1G）。這些結(jié)果表明，蝗蟲(chóng)lncRNA與mRNA在結(jié)構(gòu)和表達(dá)上有很大不同?；认x(chóng)lncRNAs更長(zhǎng)，具有更少但更長(zhǎng)的外顯子和更短的內(nèi)含子。此外，lncRNA的表達(dá)模式顯示出比mRNA更高的時(shí)間特異性。

圖1lncRNA和mRNA之間的不同結(jié)構(gòu)和表達(dá)

2、群居型蝗蟲(chóng)中特異性表達(dá)的lncRNA比在散居型蝗蟲(chóng)中表達(dá)的更多

在散居型和群居型蝗蟲(chóng)大腦中共表達(dá)9722個(gè)lncRNA（73.9％），而散居型蝗蟲(chóng)中特異性表達(dá)962個(gè)lncRNA（7.3％），群居型蝗蟲(chóng)中特定表達(dá)2469個(gè)lncRNA（18.8％）（圖2A，頂部）。分別在散居型和群居型蝗蟲(chóng)中特異性表達(dá)了479和1090個(gè)mRNA（3.1％和7.1％）（圖2A，底部）。這些結(jié)果表明，與mRNA相比，在兩個(gè)蝗蟲(chóng)相型特異性表達(dá)的lncRNA的百分比更高，而在群居蝗蟲(chóng)中比散居型蝗蟲(chóng)中表達(dá)的lncRNAs更多。與散居型蝗蟲(chóng)相比，群居型蝗蟲(chóng)中335個(gè)lncRNA和779個(gè)mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，而313個(gè)lncRNA和261個(gè)mRNA的表達(dá)上調(diào)[倍數(shù)變化（FC）>2和P<0.05；圖2B]。lincRNA在下調(diào)和上調(diào)的lncRNA中所占的比例高（分別為81.2％和87.8％），其次分別是反義外顯子和有義內(nèi)含子lncRNA（圖2B）。在表達(dá)中按FC排名的前10個(gè)lncRNA基因顯示在圖2C中。這表明散居型和群居型蝗蟲(chóng)大腦中表達(dá)的lncRNA的數(shù)量及其表達(dá)水平明顯不同。

圖2lncRNA在蝗蟲(chóng)型變中顯示出不同的表達(dá)變化模式

3、lncRNA對(duì)種群密度變化的快速應(yīng)答

為了進(jìn)一步分析lncRNA和mRNA的表達(dá)模式，使用了短時(shí)間序列表達(dá)挖掘器（ShortTime-seriesExpressionMiner，STEM）對(duì)基于表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類(lèi)。在CS期間，將214個(gè)lncRNA和242個(gè)mRNA分別分為8個(gè)和9個(gè)重要的表達(dá)譜（圖3D）。其中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜15以及mRNA表達(dá)譜15、13和16直到群居化處理后8或16小時(shí)才改變。這些配置文件稱(chēng)為后期更改的配置文件（模式d）。與后期更改的配置文件相反，早期更改的配置文件以4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化為特征。根據(jù)4小時(shí)后的表達(dá)變化，將早期變化的輪廓細(xì)分為模式a（早期變化）、模式b（早期中變化）和模式c（可持續(xù)變化）。在IG過(guò)程中，269個(gè)lncRNA和639個(gè)mRNA分別聚集成6個(gè)和7個(gè)顯著表達(dá)譜。所有l(wèi)ncRNA配置文件均為早期變化（圖3E）。在mRNA表達(dá)譜中，有6個(gè)是早期改變的，而譜12是晚期改變的。在CS和IG期間，lncRNA的聚類(lèi)分布圖的數(shù)量與mRNA的分布無(wú)明顯差異。但是，通過(guò)計(jì)算譜圖中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，發(fā)現(xiàn)早期改變的lncRNA的百分比比CS中的mRNA的百分比高61.1％（88.3％vs.54.8％，圖3F）。同樣，IG中早期改變的lncRNA的百分比高于IG中的mRNA（100％vs.81.3％，圖3F）。因此，lncRNA比mRNA對(duì)散居化和群居化處理的反應(yīng)更快。在CS中，早期改變的lncRNA的表達(dá)變化速率快于285個(gè)mRNA的表達(dá)變化速率（0.55vs.0.24）和IG（0.77vs.0.39）（圖3G）。因此，早期改變的lncRNA的比例和表達(dá)變化率高于早期改變的mRNA。因此，蝗蟲(chóng)lncRNA比mRNA對(duì)種群密度的變化更敏感。

圖3lncRNA對(duì)散居化和群居化處理的快速反應(yīng)

4、lncRNA參與CS和IG早期變化的不同途徑

在CS中，自噬調(diào)節(jié)、剪接體和肌醇磷酸代謝途徑在上位和至少兩個(gè)模塊中均過(guò)代表（圖4C）。因此，CS中早期改變的lncRNA可能在調(diào)節(jié)自噬、RNA剪接和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。lncRNA對(duì)自噬的調(diào)控參與了群居化的初期和中期，而對(duì)剪接體和磷酸肌醇代謝的調(diào)控則參與了整個(gè)過(guò)程。與神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)的突觸小泡循環(huán)途徑的lncRNA僅在模式a（早期改變）模塊中被過(guò)代表（圖4C）。該結(jié)果表明，早期改變的lncRNA可能在CS期間調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。此外，一些lncRNA與已知的型變相關(guān)基因密切相關(guān)。例如，早期改變的lncRNALNC531328.2、LNC1425451.2、LNC1088763.7和LNC492755.1與基因NPYR、NPF1a和Vat1相關(guān)（圖4A）。持續(xù)變化的lncRNALNC494161.1和LNC1065048.14與多巴胺途徑中的基因Ebony和Vat1相關(guān)。在CS網(wǎng)絡(luò)中，程度值前5％的lncRNA被視為hublncRNA（圖4A）。計(jì)算了lncRNA基因座的程度值，在CS中，基于度數(shù)排名前5％的10個(gè)lncRNA基因座被鑒定為hublncRNA。其中，四個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，其他六個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4D）。在IG期間，包括谷氨酸能突觸、多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑在內(nèi)的與突觸有關(guān)的途徑得以豐富。這些途徑中的大多數(shù)都富含早期改變的模塊。同時(shí)，多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑僅參與模式a（早期改變）的模塊（圖4E）。IG中也豐富了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如鈣信號(hào)傳導(dǎo)、Ras信號(hào)傳導(dǎo)、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑。功能注釋的結(jié)果表明，與CS相比，IG中早期變化的lncRNA參與的突觸相關(guān)和信號(hào)處理途徑更多。

圖4早期改變的lncRNA參與CS和IG的不同途徑

5、LNC1010057可能調(diào)節(jié)蝗蟲(chóng)型變

為為了驗(yàn)證LNC1010057和LNC992414在蝗蟲(chóng)型變中的功能，進(jìn)行了一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。首先，克隆了在LNC1010057和LNC992414基因座中鑒定出的長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本。LNC1010057由重復(fù)的A、B和C元素組成，這些元素依次分布并重復(fù)4次，但C元素重復(fù)三次（圖5A）。序列比對(duì)證明LNC992414在5’端與LNC1010057共享相似的重復(fù)序列，但是它們是從不同的基因組基因座轉(zhuǎn)錄而來(lái)的（圖5A）。盡管LNC992414的定量表達(dá)水平可以通過(guò)特異性引物檢測(cè)，但LNC1010057的表達(dá)水平為重復(fù)元件的總表達(dá)水平。如預(yù)期的那樣，LNC1010057和LNC992414的表達(dá)模式極為相似。在CS期間，兩種lncRNA的表達(dá)持續(xù)增加，并且在16h幾乎增加了四倍（圖5B）。在IG期間，4h后表達(dá)水平顯著下降，之后保持相對(duì)穩(wěn)定（圖5B）。LNC1010057和LNC992414之間的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式的相似性表明它們是同源的lncRNA。但是，實(shí)時(shí)qPCR分析表明，在散居型和群居型蝗蟲(chóng)的大腦中，LNC1010057的表達(dá)水平比LNC992414的表達(dá)水平高約1000倍（圖5C）。其次，為了測(cè)試LNC1010057和LNC992414是否參與蝗蟲(chóng)型變調(diào)節(jié)，在通過(guò)RNAi抑制蝗蟲(chóng)大腦中的表達(dá)后進(jìn)行了行為分析。顯著降低LNC1010057的表達(dá)水平（7470對(duì)3764610）和LNC992414（1.9vs.1.0）（圖5D）后行為分析表明，群居型蝗蟲(chóng)其行為顯著改變?yōu)樯⒕訝顟B(tài)（圖5E）。此外，多個(gè)與型有關(guān)的行為參數(shù)發(fā)生了變化?？傄苿?dòng)距離（TDM）和總移動(dòng)持續(xù)時(shí)間（TDMV）顯著降低（圖5F），但是，移動(dòng)速度沒(méi)有區(qū)別。同時(shí)群居蝗蟲(chóng)的特定喜好行為顯著下降（58.3對(duì)-13.5圖5F）。但LNC992414表達(dá)降低并未引起從群居狀態(tài)到散居狀態(tài)的轉(zhuǎn)變（圖5G和H）。與對(duì)照相比，與型相關(guān)的行為參數(shù)（包括運(yùn)動(dòng)和特定物種的優(yōu)選行為）沒(méi)有差異（圖5I）。LNC992414的RNAi實(shí)驗(yàn)不會(huì)引起行為變化，因此排除了LNC992414調(diào)節(jié)蝗蟲(chóng)型變的可能性。這些結(jié)果表明是LNC1010057而不是LNC992414潛在地調(diào)節(jié)了蝗蟲(chóng)的型變。

圖5LNC1010057潛在地調(diào)節(jié)了蝗蟲(chóng)的型變

總結(jié)

lncRNA被證實(shí)是生物過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)節(jié)包括mRNA轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾等多種生物途徑。之前研究表明昆蟲(chóng)lncRNA參與了例如殺蟲(chóng)劑抗性、繁殖力和腺體凋亡等生物過(guò)程，但是尚未有證據(jù)證明lncRNA可以調(diào)節(jié)非模型昆蟲(chóng)的行為?；认x(chóng)是世界范圍內(nèi)的一種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，表現(xiàn)出顯著的表型可塑性。為了鑒定與其型變相關(guān)的lncRNA，本文系統(tǒng)地分析了蝗蟲(chóng)lncRNA的表達(dá)并注釋其功能，證實(shí)與mRNAs相比lncRNAs顯示對(duì)型變更敏感的響應(yīng)，并證實(shí)了其中一個(gè)lncRNA可調(diào)節(jié)型變相關(guān)行為。本研究揭示了lncRNA在蝗蟲(chóng)型變中的重要作用以及表型中蛋白編碼基因和lncRNA之間的相互作用。深入解析蝗蟲(chóng)散居型和群居型轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，為可持續(xù)治理蝗蟲(chóng)的新策略和新方法的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。