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空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)

定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的活躍表達(dá)

產(chǎn)品介紹

空間轉(zhuǎn)錄組是從空間層面上解析RNA-seq數(shù)據(jù)的技術(shù)，從而解析單個(gè)組織切片中的所有mRNA，從而能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的活躍表達(dá)。

細(xì)胞在組織內(nèi)的物理位置是決定其分子特性的關(guān)鍵因素

普通轉(zhuǎn)錄組

得到組織中混合細(xì)胞（bulk）表達(dá)情況，無(wú)法解析細(xì)胞表達(dá)異質(zhì)性，即無(wú)法得到每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)情況。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組

10x genomics等單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以得到每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)情況，從而解析組織內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性。

空間轉(zhuǎn)錄組

10x visium等將組織切片與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合，實(shí)現(xiàn)空間信息和轉(zhuǎn)錄本信息的獲取。添加基因表達(dá)空間分布信息，進(jìn)一步提高組織內(nèi)部分辨率。

技術(shù)原理

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理

  • 1、對(duì)新鮮冷凍組織進(jìn)行切片，并進(jìn)行成像。
  • 2、將組織切片放置在含有與RNA結(jié)合捕獲探針的載玻片上，并進(jìn)行固定和透化（使細(xì)胞中的mRNA得到釋放，并結(jié)合到相應(yīng)的捕獲探針上，從而獲取基因表達(dá)信息）。
  • 3、以捕獲的RNA為模板進(jìn)行cDNA合成和測(cè)序文庫(kù)制備。
  • 4、對(duì)制備好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。
  • 5、數(shù)據(jù)可視化分析（確定哪些基因得到表達(dá)，基因表達(dá)量，以及這些基因的空間位置信息）。

10x Genomics空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理

 

10x Genomics空間轉(zhuǎn)錄組用于文庫(kù)構(gòu)建的每張載玻片上有四個(gè)捕獲區(qū)域，每個(gè)捕獲區(qū)域的大小為6.5×6.5mm，包含5000個(gè)被條形碼標(biāo)記的點(diǎn)（barcoded spots），每個(gè)點(diǎn)的直徑為55 μm，點(diǎn)和點(diǎn)之間中心的距離為100 μm，并且每個(gè)點(diǎn)都有一個(gè)唯一的barcode序列。

組織切片的細(xì)胞中會(huì)釋放出mRNA，遷移到每個(gè)spot的mRNA會(huì)被標(biāo)記上相應(yīng)的barcode序列，然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并進(jìn)行測(cè)序。

最后，根據(jù)數(shù)據(jù)的條形碼信息對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定哪些數(shù)據(jù)來(lái)自哪個(gè)位置，從而實(shí)現(xiàn)空間基因表達(dá)的可視化。

應(yīng)用方向

  • 病理學(xué)

    通過(guò)添加基因表達(dá)維度，得出形態(tài)學(xué)結(jié)論

  • 免疫學(xué)

    免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)特征

  • 發(fā)育生物學(xué)

    發(fā)現(xiàn)組織背景中與形態(tài)形成有關(guān)的基因

  • 神經(jīng)科學(xué)

    繪制大腦的各個(gè)細(xì)胞層、區(qū)分正常與患病的大腦解剖特征

  • 腫瘤學(xué)

    腫瘤微環(huán)境、腫瘤異質(zhì)性、病程進(jìn)展、癌癥形態(tài)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞

結(jié)果展示

?小鼠腎臟空間轉(zhuǎn)錄組的mRNA表達(dá)及聚類

A代表組織切片的HE染色。B和C分別代表UMI計(jì)數(shù)和總基因計(jì)數(shù)與組織空間位置的圖像疊加。D代表基于總體差異表達(dá)基因的空間聚類結(jié)果，最右邊顯示了cluster2排名前10的特異表達(dá)基因。E、F、G、H分別代表了不同基因的空間mRNA表達(dá)。

小鼠大腦空間分辨率的基因表達(dá)

A代表組織切片的HE染色。B和C分別代表海馬組織的標(biāo)記基因Tmsb4x和Selenow基因的空間表達(dá)情況，結(jié)果顯示這兩個(gè)基因在海馬體中顯著高表達(dá)，符合已知的基因表達(dá)模式

常見(jiàn)問(wèn)題

數(shù)據(jù)量如何確定

樣本類型、Coverage、表達(dá)量不同、數(shù)據(jù)量也會(huì)不同，數(shù)據(jù)量推薦≥50k reads pairs per spot，(50% tissue coverage * 5000 total spots) * 50,000 read pairs per spot= 125 million read pairs (250M total reads)。故，推薦數(shù)據(jù)量30G-60G/樣

空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)如何可視化？

詳情見(jiàn)：空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可視化介紹–loupe browser

樣本如何制備？

實(shí)驗(yàn)流程為：新鮮組織取樣-異戊烷凍存-OCT包埋-冷凍切片-染色-顯微鏡觀察-建庫(kù)測(cè)序 需要客戶準(zhǔn)備：新鮮組織取樣–異戊烷凍存（保存或運(yùn)輸）–OCT包埋–保存或運(yùn)輸 客戶在制備樣本時(shí)，需要準(zhǔn)備3份樣本（至少2份），每塊組織樣本不宜過(guò)大（長(zhǎng)寬高約0.8 cm ）

a.一份用于常規(guī)RNA提取，以確保樣本自身及樣本制備不存在問(wèn)題，當(dāng)RNA RIN>8時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

b.一份用于正常的切片實(shí)驗(yàn)

c.一份用作備份

詳情見(jiàn)：【空間轉(zhuǎn)錄組】樣本制備（一）

空間轉(zhuǎn)錄組的已發(fā)表文獻(xiàn)有哪些？

標(biāo)題

時(shí)間 期刊 題目 IF 類別
2020.01 Nature Biotechnology Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas 31.864? PDAC腫瘤異質(zhì)性
2020.01 Nature cell biology Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization 17.428 骨髓造血微環(huán)境
2019.12 Cell A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart 36.216 人類心臟發(fā)育
2019.04 Science Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis 41.037 肌萎縮性側(cè)索硬化癥
2018.11 Nat Protoc Barcodedsolid-phase RNA capture SpatialTranscriptomics pro?ling mammaliantissue sections 11.334 實(shí)驗(yàn)方法
2018.10 Cancer Research Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma 8.378 黑色素瘤異質(zhì)性
2018.06 Nat Commun Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity 11.878 前列腺癌異質(zhì)性

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