提到單細(xì)胞測(cè)序，我們腦中更多浮現(xiàn)得是scRNA-Seq(single-cell RNA -sequencing)；scRNA-seq是目前常用的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，但是逐漸呈現(xiàn)出一些固有的方法學(xué)問(wèn)題：組織類(lèi)型偏好（無(wú)法分析難解離的組織和凍存組織等）；在細(xì)胞懸液制備中會(huì)引入一些轉(zhuǎn)錄偏好；組織解離時(shí)得到易于解離下來(lái)的細(xì)胞，敏感的細(xì)胞可能在解離時(shí)破碎；目前商業(yè)化的單細(xì)胞平臺(tái)都對(duì)細(xì)胞大小有限制等。

snRNA-seq(single-nucleus RNA-sequencing)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到研究者的青睞，逐漸呈現(xiàn)出較為火熱的景象。目前在多種動(dòng)植物組織，如腫瘤組織^[1]、腦^[7]、腎臟^[3]、心臟^[8]和脂肪^[4]中得到應(yīng)用，在植物單細(xì)胞中也逐漸展現(xiàn)了其優(yōu)勢(shì)^[5]。snRNA-seq是否可以和scRNA-Seq一樣，得到一致的結(jié)果，解析生物學(xué)特征，兩者之間有哪些差異，下面幾篇文獻(xiàn)可以略解您的疑慮，帶您初識(shí)snRNA-seq。

1、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.

發(fā)表雜志：Nature Medicine

影響因子：36.13

發(fā)表時(shí)間：2020. 6. 25

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Chromium

實(shí)驗(yàn)材料：新鮮和凍存的8種腫瘤組織，如NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）， ?NB（成神經(jīng)細(xì)胞瘤），MBC（轉(zhuǎn)移性乳腺癌），GBM（腦膠質(zhì)瘤），CLL（慢性淋巴細(xì)胞白血?。?，Ovarian（卵巢癌），Melanoma（黑色素瘤）和肉瘤。

研究?jī)?nèi)容：開(kāi)發(fā)了一種系統(tǒng)工具箱，可以分別通過(guò)scRNA-Seq和 ?snRNA-Seq對(duì)新鮮和冷凍的臨床腫瘤樣品進(jìn)行分析；對(duì)同樣的樣品進(jìn)行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析，結(jié)果顯示它們可以得到相同的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種細(xì)胞類(lèi)型的占比不同。

主要結(jié)果：

a.?建立了系統(tǒng)性的scRNA-Seq和snRNA-Seq的實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析流程

研究了8種不同類(lèi)型的腫瘤組織，通過(guò)不同取樣方式，共獲得不同部位共23個(gè)標(biāo)本的40個(gè)樣品的216,490個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞核，這些樣品具有豐富的組織和樣品多樣性；對(duì)不同的細(xì)胞和細(xì)胞核分離方式，在實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析中對(duì)細(xì)胞/細(xì)胞核質(zhì)量、細(xì)胞/細(xì)胞核回收率、靈敏度、細(xì)胞類(lèi)型和CNV 分析等方面進(jìn)行評(píng)估，確定了實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析流程（圖1-1）；通過(guò)對(duì)8種腫瘤組織實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較，推薦了細(xì)胞和細(xì)胞核分離方式（圖1-2）。

圖1-1 sc/snRNA-Seq 實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析流程

圖1-2 不同腫瘤組織樣品信息和細(xì)胞/細(xì)胞核分離方式

?

b.?scRNA-Seq和snRNA-Seq可以得到相同的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種細(xì)胞類(lèi)型的占比不同

對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤（HTAPP-656）、轉(zhuǎn)移性乳腺癌?(HTAPP-963)、CLL (CLL1) 和 O-PDX (O-PDX1)相同的樣品同時(shí)進(jìn)行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析。兩種方法可以得到相同的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種細(xì)胞類(lèi)型的占比不同；在成神經(jīng)細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，scRNA-Seq獲得更多的免疫細(xì)胞，snRNA-Seq得到更多的惡性腫瘤細(xì)胞（圖1-3）；細(xì)胞檢測(cè)到解離信號(hào)的比例比細(xì)胞核高，且信號(hào)值較高；在細(xì)胞和細(xì)胞核中，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的解離信號(hào)更加明顯（圖1-4）。

圖1-3 scRNA-Seq and snRNA-Seq結(jié)果比較

圖1-4 ?scRNA-Seq and snRNA-Seq解離信號(hào)比較

2.Systematic comparison of single-cell and?single-nucleus RNA-sequencing methods

發(fā)表雜志：Nature biotechnology影響因子：36.558發(fā)表時(shí)間：2020. 4. 6實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-Seq:低通量(Smart-seq2和CEL-Seq2）和高通量(10x Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops和sci-RNA-seq)snRNA-Seq:Smart-seq2、10x Chromium、DroNc-Seq和sci-RNA-seq

實(shí)驗(yàn)材料：

scRNA-Seq：人（HEK293）和小鼠（NIH3T3）等比例混合細(xì)胞系和凍存人類(lèi)PBMC（2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）；snRNA-Seq：凍存小鼠大腦皮層（2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）Bulk RNA-Seq：以上3種材料
研究?jī)?nèi)容：選擇2種低通量和5種高通量方法進(jìn)行scRNA-Seq或snRNA-Seq分析；為了直接比較、避免每種方法已有流程的影響，作者開(kāi)發(fā)了一種更加靈活、適用于任何scRNA-Seq的方法“scumi”；通過(guò)比較reads的結(jié)構(gòu)和比對(duì)情況、靈敏度、多胞率和解釋已知的生物學(xué)信息評(píng)估每種方法；兩種低通量方法表現(xiàn)相似，CEL-Seq2受其他細(xì)胞污染reads的影響比較明顯；10x Chromium在高通量方法中表現(xiàn)更優(yōu)。

主要結(jié)果：

a. scumi：可以對(duì)任一scRNA-Seq方法進(jìn)行一致性分析的數(shù)據(jù)分析流程

首先，開(kāi)發(fā)了“scumi”軟件包，從FASTQ文件到產(chǎn)生適用下游分析的基因和細(xì)胞參數(shù)；其次，提出了下游分析前過(guò)濾低質(zhì)量細(xì)胞的方案，這也是數(shù)據(jù)預(yù)處理的重要挑戰(zhàn)，然后對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行相同的reads數(shù)分析；最后，通過(guò)關(guān)鍵的參數(shù)對(duì)每種方法進(jìn)行評(píng)估：①比對(duì)到細(xì)胞核和線粒體基因組的reads 及其結(jié)構(gòu)；②捕獲RNA的靈敏度；③多胞率；④準(zhǔn)確性和重復(fù)性；⑤得到細(xì)胞類(lèi)型中重要的生物學(xué)差異的能力（圖2-1）。

圖2-1 scumi數(shù)據(jù)分析流程

b.?reads結(jié)構(gòu)和比對(duì)到基因組的信息顯示不同方法具有效率差異結(jié)果顯示，不同的方法在預(yù)期的位置沒(méi)有Poly（T）reads比例明顯不同；外顯子、內(nèi)含子、基因間、重疊的差異基因、多重比對(duì)以及無(wú)法比對(duì)的reads不同方法間基本一致；但是細(xì)胞核中內(nèi)含子reads與外顯子reads的比率明顯高于細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞核中有較高比例未剪切的轉(zhuǎn)錄本（圖2-2）。

圖2-2 測(cè)序reads的基因組比對(duì)特征（a. Mixture, b.PBMCs, c.Cortex ）

c.?不同實(shí)驗(yàn)每種方法的靈敏度相對(duì)一致

結(jié)通過(guò)分析每個(gè)細(xì)胞的reads數(shù)、UMIs 和基因數(shù)比較每種方法的靈敏度（即捕獲RNA的能力）；7種方法中，低通量方法靈敏度最高，高通量方法中10x Chromium 每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的UMI和基因數(shù)最多（圖2-3）。

圖2-3不同實(shí)驗(yàn)每種方法的靈敏度比較

d.?不同的方法區(qū)別和獲得細(xì)胞類(lèi)型的能力不同

選擇轉(zhuǎn)錄組分析方法最重要的一項(xiàng)指標(biāo)就是這種方法能否解釋感興趣的生物學(xué)信息。為了更加公平的分析每種方法，我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了一致性處理；選擇相同的Reads/cell 和cells/實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞分群和細(xì)胞類(lèi)型鑒定。

在PBMCs中，每種方法都可以獲得豐富的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種類(lèi)型的豐度不同，且獲得稀有細(xì)胞類(lèi)型的能力有差異（如漿狀樹(shù)突細(xì)胞）；每種方法都有一定程度的血小板污染。

在大腦皮層中，細(xì)胞核分析得到小鼠大腦皮層多種細(xì)胞類(lèi)型，包括興奮和抑制性神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞,少膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)祖細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞，其中周皮細(xì)胞只在DroNc-Seq Cortex1 中發(fā)現(xiàn)；sci-RNA-seq未得到少突膠質(zhì)祖細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞（圖2-4）。

圖2-4不同實(shí)驗(yàn)不同方法細(xì)胞類(lèi)型的比較

發(fā)表期刊：J Am Soc Nephrol

影響因子：9.274

發(fā)表時(shí)間：2019.1

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：

scRNA-seq ：DropSeq

snRNA-seq：sNuc-DropSeq, DroNc-seq和?10x Chromium

實(shí)驗(yàn)材料：8周大的小鼠腎臟

研究?jī)?nèi)容：

在比較分析中共產(chǎn)生?11,391?個(gè)轉(zhuǎn)錄本。scRNA-seq鑒定了10個(gè)細(xì)胞簇，包括一個(gè)人為解離誘導(dǎo)的壓力相應(yīng)基因群，但是未鑒定到腎小球細(xì)胞。相反，3種snRNA-seq都鑒定到更加多樣性的腎細(xì)胞類(lèi)型，包括腎小球足細(xì)胞，系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，未檢測(cè)到壓力響應(yīng)基因；檢測(cè)到的腎小球足細(xì)胞的比例是已知發(fā)表的scRNA-seq 數(shù)據(jù)的20倍（2.4% versus 0.12%）。更出乎意料的是，snRNA-seq和scRNA-seq 的基因檢測(cè)靈敏度一致。為了驗(yàn)證snRNA-se方法的有效性，分析了經(jīng)過(guò)纖維化和炎癥UUO治療第14天冷凍腎組織，鑒定了罕見(jiàn)近腎小球細(xì)胞，新活化的近端小管和成纖維細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)，以及之前未知的腎小管間質(zhì)信號(hào)通路。

主要結(jié)果:a.?snRNA-seq增加內(nèi)含子序列分析可以達(dá)到scRNA-seq一致的靈敏度

snRNA-seq將內(nèi)含子和外顯子數(shù)據(jù)同時(shí)分析時(shí)，平均的reads、genes?和scRNA-seq相對(duì)一致；但是scRNA-seq的線粒體基因比例高達(dá)24%；將線粒體的基因過(guò)濾之后，3種snRNA-seq檢測(cè)基因的能力均高于scRNA-seq；選擇1469個(gè)上皮細(xì)胞進(jìn)行tSNE 降維可視化分析，如果將外顯子和內(nèi)含子數(shù)據(jù)同時(shí)進(jìn)行分析，可以將DroNc-seq的細(xì)胞類(lèi)型增加到6個(gè)，但是?scDropSeq 的細(xì)胞類(lèi)型沒(méi)有增加；雖然多了一個(gè)細(xì)胞簇，但是該簇主要表達(dá)解離時(shí)誘導(dǎo)的壓力響應(yīng)基因（圖3-1）。

圖3-1?內(nèi)含子對(duì)snRNA-seq?數(shù)據(jù)的影響

?

b.?snRNA-seq鑒定了3個(gè)特有的細(xì)胞類(lèi)型

將4種方法的數(shù)據(jù)整合分析，共鑒定了13個(gè)細(xì)胞簇，包括足細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞；3種snRNA-seq 檢測(cè)足細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和閏細(xì)胞的靈敏度更高；但是scRNA-seq未檢測(cè)到任何足細(xì)胞。差異基因表達(dá)分析顯示，?71.4%?基因在細(xì)胞和細(xì)胞核中都被檢測(cè)到；在檢測(cè)到的基因中，僅僅?5.0%?在細(xì)胞中的表達(dá)量高于細(xì)胞核，6.4%的基因在細(xì)胞核中的表達(dá)量高于細(xì)胞（fold change>1.5，?P value <0.05）（圖3-2）；scRNA-seq高表達(dá)基因包括線粒體、核糖體基因和熱休克途徑中的基因；snRNA-seq高表達(dá)基因包括溶質(zhì)載體、轉(zhuǎn)錄因子和Non-coding?RNA基因。

圖3-2 ??snRNA-seq?和scRNA-seq?差異分析?

?c.??snRNA-seq?分析經(jīng)過(guò)纖維化和炎癥UUO治療的冷凍腎組織

利用?10x Chromium?snRNA-seq對(duì)6147單細(xì)胞核分析經(jīng)過(guò)纖維化和炎癥UUO治療第14天冷凍腎組織，鑒定了增殖近端小管細(xì)胞、去分化近端小管和腎小球旁細(xì)胞；推測(cè)了未知的腎小管間質(zhì)信號(hào)通路（圖3-3）。

圖3-3 ??snRNA-seq?對(duì)UUO治療冷凍腎組織的分析結(jié)果

發(fā)表信息：Nature；2020.10.28；IF：42.778。

單細(xì)胞平臺(tái)：Smart-Seq2?和10x Chromium

推薦理由:

通過(guò)對(duì)小鼠和人進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的新的細(xì)胞類(lèi)型P4；通過(guò)對(duì)marker基因Cyp2e1和Aldh1a1的深度分析確定P4的主要功能，如免疫熒光染色，基因過(guò)表達(dá)、基因敲除，共表達(dá)等功能驗(yàn)證技術(shù)。證明了這個(gè)亞群通過(guò)醋酸鹽介導(dǎo)的調(diào)節(jié)其產(chǎn)熱能力來(lái)調(diào)節(jié)鄰近脂肪細(xì)胞的活動(dòng)。人類(lèi)脂肪組織中含有較高數(shù)量的該亞群細(xì)胞，這可能解釋了與小鼠脂肪組織相比，人的產(chǎn)熱活性較低的原因，并提示靶向該途徑可用于恢復(fù)產(chǎn)熱活性。

5. The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana?

發(fā)表信息：bioRxiv preprint；doi:?https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156；?2020.07.28

單細(xì)胞平臺(tái)：10x Chromium

推薦理由:

利用原生質(zhì)體進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序困難重重，如原生質(zhì)體獲得困難（不同物種、不同發(fā)育時(shí)期和不同器官細(xì)胞壁成分不同），解離對(duì)基因表達(dá)的影響，原生質(zhì)體細(xì)胞大小超出平臺(tái)的限制等；為了克服原生質(zhì)體的困難，作者進(jìn)行了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析；與已經(jīng)發(fā)表的文章相比，不僅驗(yàn)證了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組可以對(duì)擬南芥根進(jìn)行分析，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了3種新的細(xì)胞類(lèi)型；通過(guò)單細(xì)胞ATAC-Seq和snRNA-Seq?多組學(xué)聯(lián)合分析揭示染色質(zhì)重塑對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響，證明細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記基因也顯示細(xì)胞類(lèi)型特異性的染色質(zhì)可及性模式。我們的數(shù)據(jù)表明，染色質(zhì)的不同重塑是在細(xì)胞類(lèi)型水平上調(diào)控基因活動(dòng)的關(guān)鍵機(jī)制。

綜上所述，snRNA-Seq?分析細(xì)胞核內(nèi)的RNA，可以解釋相應(yīng)的生物學(xué)信息；snRNA-Seq?含有較多未剪切的轉(zhuǎn)錄本，包含內(nèi)含子的序列進(jìn)行分析，不僅可以提高提高RNA的捕獲能力，同時(shí)可以得到更多的稀有細(xì)胞類(lèi)型；snRNA-seq解決了scRNA-seq中固有的一些問(wèn)題，能夠獲得更為準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

近幾年來(lái)，snRNA-Seq受到越來(lái)越多的青睞，文獻(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)較為迅速；為特殊樣品（如冷凍組織）的單細(xì)胞研究提供新的途徑；為細(xì)胞單細(xì)胞研究開(kāi)辟了新的思路。

snRNA-Seq和scRNA-Seq?是目前解析各種生命現(xiàn)象、揭示各種生物學(xué)機(jī)制的強(qiáng)有力的技術(shù)手段，各有千秋，研究者需要結(jié)合自身的條件來(lái)確定；如scRNA-Seq在神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活態(tài)（microglial activation）的研究中更勝一籌^[6]。我們期待越來(lái)越多的研究者來(lái)解析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)這浩瀚的星空，發(fā)現(xiàn)更多耀眼的星。

百邁客引進(jìn)10xGenomics單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，使用Chromium系統(tǒng)采用微流控、油滴包裹和barcode標(biāo)記等技術(shù)實(shí)現(xiàn)一次性分離、高效標(biāo)記捕獲；同時(shí)具有10x?單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫(kù)、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，實(shí)現(xiàn)10x平臺(tái)全面優(yōu)質(zhì)服務(wù)；已經(jīng)具有大量單細(xì)胞分離捕獲，極低量RNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增建庫(kù)成功經(jīng)驗(yàn)；提供單細(xì)胞分離捕獲、反轉(zhuǎn)錄建庫(kù)、測(cè)序、標(biāo)準(zhǔn)分析和高級(jí)分析全套單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)；強(qiáng)大的生信團(tuán)隊(duì)不僅提供基本分析，還提供細(xì)胞分化軌跡分析等多種高級(jí)分析；資深單細(xì)胞技術(shù)人員為您提供專(zhuān)業(yè)的課題方案設(shè)計(jì)，為您量身訂造專(zhuān)屬個(gè)性化分析。點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，將可免費(fèi)獲得文章思路設(shè)計(jì)方案。

參考文獻(xiàn)

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[5]Andrew Farmer1, Sandra Thibivilliers , Kook Hui Ryu,??et al.The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana.bioRxiv preprint,doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156;2020.07.28

[6]Single-Nucleus RNA-Seq Is Not Suitable for Detection of Microglial Activation Genes in Humans.Nicola Thrupp, Carlo Sala Frigerio, Leen Wolfs, et al.Cell Reports , 2020(32):1-8

[7]Dissecting Cell-Type Composition and Activity_Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.Peng Hu, Emily Fabyanic,Deborah Y. Kwon, Sheng Tang,Zhaolan Zhou, Hao Wu.Molecular Cell.2017(68):1006–1015

[8]Systematic Comparison of High throughput Single-Cell and Single Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Diferentiation.Alan Selewa1, Ryan Dohn1, Heather Eckart, et al.Nature Scientific Reports | (2020) 10:1535

研究背景

阿爾茨海默氏癥的癡呆癥隨著神經(jīng)變性的進(jìn)展而發(fā)展，但導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的具體事件仍然鮮為人知。在正常衰老期間，神經(jīng)元以類(lèi)似于分裂細(xì)胞的速度逐漸積累軀體突變，這表明遺傳因素、環(huán)境暴露或疾病狀態(tài)可能會(huì)影響這種積累在這里，本文分析了來(lái)自阿爾茨海默病患者和神經(jīng)典型對(duì)照個(gè)體前額葉皮層和海馬體的319個(gè)神經(jīng)元的單細(xì)胞全基因組測(cè)序（scWGS）數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏癥患者的體細(xì)胞DNA改變?cè)黾?，分子模式不同，正常神?jīng)元主要以與年齡相關(guān)的模式（特征A）積累突變，這與之前在健康和癌細(xì)胞中描述的“時(shí)鐘狀”突變特征非常相似。神經(jīng)變性中DNA改變的異常積累為阿爾茨海默病發(fā)展過(guò)程中發(fā)生的分子和細(xì)胞事件的級(jí)聯(lián)提供了見(jiàn)解。

材料方法

材料：年輕的神經(jīng)典型對(duì)照組（9人）、老年神經(jīng)典型對(duì)照組（11人）、阿爾茨海默氏病患者（9人）；一共29人，總計(jì)：319個(gè)神經(jīng)元，172個(gè)PFC-MDA神經(jīng)元，78個(gè)HC-MDA神經(jīng)元，69個(gè)PFC-PTA神經(jīng)元

方法：對(duì)319個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測(cè)序。

研究結(jié)論

AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過(guò)了僅因衰老而發(fā)生的水平。AD神經(jīng)元中基因組SNV積累的模式似乎與正常衰老的加重不同，這表現(xiàn)為（1）特征C的豐富，特征C存在于神經(jīng)典型對(duì)照個(gè)體的大腦中，但有限；（2）特征特異性轉(zhuǎn)錄影響。這些基因組變化可能包括一系列表現(xiàn)形式，包括單鏈DNA病變和雙鏈突變。AD神經(jīng)元體細(xì)胞改變的具體模式還提供了關(guān)于其原因和AD發(fā)病機(jī)制潛在影響的線索并確定潛在的治療目標(biāo)，scWGS技術(shù)深度揭示AD疾病發(fā)病機(jī)制與體細(xì)胞突變的積累有關(guān)，為其治療提供了理論基礎(chǔ)。

技術(shù)路線圖

主要研究結(jié)果

1、衰老期間神經(jīng)元的體細(xì)胞突變

對(duì)從AD和神經(jīng)典型對(duì)照個(gè)體的大腦中分離出來(lái)的神經(jīng)元進(jìn)行了單細(xì)胞全基因組測(cè)序（scWGS），染色了泛神經(jīng)元標(biāo)記NeuN來(lái)標(biāo)記神經(jīng)元，并進(jìn)一步只標(biāo)記了大的NeuN陽(yáng)性核，使用多位移放大（MDA）進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，分析了8例AD的91個(gè)神經(jīng)元和18個(gè)神經(jīng)典型對(duì)照組的159個(gè)神經(jīng)元。在神經(jīng)典型個(gè)體中，神經(jīng)元sSNVs隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，sSNVs的年增長(zhǎng)率相當(dāng)高，從每年13到55個(gè)sSNV不等，在一些特殊細(xì)胞類(lèi)型中，分裂突變率更高。沒(méi)有神經(jīng)診斷的個(gè)體的海馬CA1神經(jīng)元顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，sSNVs呈積累的趨勢(shì)，這與神經(jīng)典型對(duì)照個(gè)體前額葉皮層（PFC）神經(jīng)元中看到的sSNV的增加沒(méi)有顯著差異。

圖1 對(duì)照個(gè)體和AD個(gè)體中單個(gè)神經(jīng)元的體細(xì)胞突變

在正常的PFC神經(jīng)元中，與年齡相關(guān)的突變?cè)黾又饕赡承〤>T和T>C變化驅(qū)動(dòng)，從PFC和海馬錐體神經(jīng)元的復(fù)合數(shù)據(jù)集中對(duì)sSNVs進(jìn)行簽名分解分析表明，簽名A在每個(gè)神經(jīng)元中的貢獻(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，每年獲得15.0±1.2 sSNVs。這種與年齡相關(guān)的特征A突變的增加與PFC和海馬錐體神經(jīng)元相似（P = 0.18，線性混合模型），并且是正常神經(jīng)元中與年齡相關(guān)的sSNV積累的主要驅(qū)動(dòng)因素。轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄相關(guān)損傷或無(wú)效修復(fù)使表達(dá)的位點(diǎn)對(duì)軀體突變敏感。

2、AD中的體細(xì)胞突變特征分析

評(píng)估了8名AD患者大腦神經(jīng)元中sSNVs的負(fù)擔(dān)，發(fā)現(xiàn)AD神經(jīng)元sSNVs明顯高于預(yù)期。AD神經(jīng)元在MDA實(shí)驗(yàn)中也顯示sSNVs顯著增加。在PFC中，在八例AD個(gè)體病例中觀察到AD中sSNVs相對(duì)于正常衰老的顯著增加。AD中sSNV計(jì)數(shù)高的幾個(gè)基因組來(lái)自海馬體，其中8例中有5例與正常衰老相比，sSNVs顯著增加。AD中的神經(jīng)元包含數(shù)百種額外的sSNV，超出了其年齡的預(yù)期，這表明該疾病過(guò)程產(chǎn)生的基因組損傷水平與十多年來(lái)sSNV的正常積累相當(dāng)。變異的廣泛基因組分布表明，體細(xì)胞突變不是構(gòu)成疾病發(fā)病機(jī)制的特定初始事件，而是繼發(fā)性的，這是由引發(fā)AD和誘變過(guò)程的其他事件引起的。

AD神經(jīng)元的突變特征分析，在所有樣本中，A突變都會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，這表明這種時(shí)鐘狀特征（與癌癥5的時(shí)鐘樣特征SBS5最相似）構(gòu)成了基因組老化的固有特征。簽名A還顯示，相對(duì)于年齡匹配的控制，AD略有增加，這在這些MDA實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表明這些突變機(jī)制在疾病環(huán)境中可能會(huì)被強(qiáng)調(diào)。另一方面，AD神經(jīng)元與對(duì)照組相比，簽名C明顯增加。鑒于AD4.31-33中報(bào)告了活性氧（ROS）和氧化核酸病變的增加，在AD中積累標(biāo)志性C的合理機(jī)制是，氧化損傷的增加壓倒了NER，而NER也可能在AD中也會(huì)減弱。

圖2 AD中的體細(xì)胞突變特征

由于我們的突變特征分析表明，DNA氧化——之前在AD4.11患者大腦的批量分析中觀察到——可能會(huì)導(dǎo)致AD中過(guò)量的sSNV，使用針對(duì)8-oxoG的抗體進(jìn)行免疫熒光顯微鏡顯示，AD神經(jīng)元中的8-oxoG水平明顯高于神經(jīng)典型對(duì)照神經(jīng)元。表明氧化核苷酸損傷水平的增加有助于C>A變化和AD神經(jīng)元中標(biāo)志性C的增加。

對(duì)神經(jīng)元功能和生存至關(guān)重要的基因突變可能會(huì)直接影響細(xì)胞適應(yīng)性，對(duì)于簽名A，轉(zhuǎn)錄期間的事件似乎在產(chǎn)生突變方面發(fā)揮作用，而簽名C與表達(dá)式成反比，因此可以在轉(zhuǎn)錄期間更有效地修復(fù)，包括通過(guò)TC-NER35修復(fù)。對(duì)AD和對(duì)照神經(jīng)元中位突變的基因本體學(xué)（GO）分析顯示，參與神經(jīng)元功能的基因被sSNVs豐富。當(dāng)與表達(dá)式-sSNV結(jié)果一起考慮時(shí)，AD神經(jīng)元顯示轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)突變生成的影響，這種轉(zhuǎn)錄影響可以在配對(duì)的DNA鏈上產(chǎn)生不對(duì)稱(chēng)的突變模式。

在蛋白質(zhì)編碼基因中，AD神經(jīng)元表現(xiàn)出比年齡匹配的對(duì)照神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的非同義突變，對(duì)AD37腦脊液和腦組織中的克隆CD8+ T細(xì)胞的觀察表明，這種自激活可能與AD有關(guān)。功能失調(diào)的神經(jīng)元在AD中會(huì)明顯更豐富，這可能會(huì)因某些AD相關(guān)基因的長(zhǎng)度而加?。灰虼藫p害神經(jīng)元功能可能是sSNVs影響細(xì)胞生理學(xué)的一種方式。

圖3 AD中的體細(xì)胞突變對(duì)轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)的影響

3、PTA擴(kuò)增對(duì)AD神經(jīng)元基因組突變特征分析

基于PTA（初級(jí)模板定向放大）的人類(lèi)神經(jīng)元scWGS證實(shí)，體細(xì)胞突變隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。對(duì)MDA分析的大多數(shù)大腦的神經(jīng)元小樣本（來(lái)自7例AD的29個(gè)神經(jīng)元和13個(gè)神經(jīng)典型對(duì)照組的40個(gè)神經(jīng)元）進(jìn)行了基于PTA的scWGS，并確認(rèn)AD神經(jīng)元與對(duì)照組相比包含更多的改變，PTA檢測(cè)到的sSNVs代表雙鏈體細(xì)胞突變。
PTA檢測(cè)到的突變，這再次證實(shí)了簽名A突變以時(shí)鐘般的方式隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，AD神經(jīng)元中的簽名A略有顯著增加（P = 0.04，線性混合模型）。AD神經(jīng)元總突變的增加一樣，PTA突變特征發(fā)現(xiàn)反映了MDA放大神經(jīng)元基因組的趨勢(shì)。其中包括SBS8和SBS30，它們與DNA修復(fù)酶NTHL1有關(guān)，NTHL1參與氧化性病變修復(fù)。轉(zhuǎn)錄區(qū)域PTA檢測(cè)到的sSNVs負(fù)荷與大腦中的基因表達(dá)水平相關(guān)，而簽名A和C突變顯示的模式與MDA檢測(cè)到的sSNV相似，指出轉(zhuǎn)錄活動(dòng)對(duì)突變發(fā)生的特殊影響。因此，兩種scWGS方法都確定了類(lèi)似的模式，并表明AD中的致病突變機(jī)制包括DNA氧化、NER DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄活性。

圖4. PTA對(duì)單個(gè)AD神經(jīng)元的體細(xì)胞突變分析

總結(jié)

兩種不同的單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)揭示了AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過(guò)了僅因衰老而發(fā)生的水平，未來(lái)探索更多的體細(xì)胞突變模式解釋這些氧化性病變?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)與衰老過(guò)程中發(fā)生的突變相互作用來(lái)?yè)p害基因組功能。

如果您對(duì)單細(xì)胞全基因組測(cè)序感興趣，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費(fèi)為您設(shè)計(jì)文章思路方案。

文章題目：T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：17.694

研究背景

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種起源于腦部膠質(zhì)細(xì)胞的、顱內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤通常發(fā)生于成人，其累及大腦的頻率高于脊髓。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有時(shí)也稱(chēng)為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）或IV級(jí)星形細(xì)胞瘤。由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)表型發(fā)生變化后，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，浸潤(rùn)腦組織、抑制免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)血管再生。同時(shí)腫瘤細(xì)胞還能夠改變內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元等正常腦細(xì)胞，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)，并對(duì)治療產(chǎn)生抗性。

今天分享一篇2022年3月發(fā)表在Nature Communications上的一篇名為“T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10”的文章，這篇文章中作者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)了髓系細(xì)胞分泌的白介素-10（IL-10）驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞功能障礙，最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，以及抑制免疫反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

髓樣細(xì)胞分泌IL-10驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞耗竭

該團(tuán)隊(duì)對(duì)?8?名診斷為新發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者腫瘤組織樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)“S1”狀態(tài)與?T?細(xì)胞耗竭/功能障礙標(biāo)志物（HAVCR2、CTLA4?和?PDCD1）的表達(dá)增加，為了確定與?T?細(xì)胞耗竭相關(guān)的轉(zhuǎn)錄途徑，進(jìn)行了通路信號(hào)傳導(dǎo)推斷，揭?示了?T?細(xì)胞耗竭與?IL-10?以及部分?TGF??反應(yīng)之間存在著相關(guān)性。

T?細(xì)胞中?IL-10?下游信號(hào)傳導(dǎo)通路反應(yīng)的擾動(dòng)模擬驗(yàn)證

該團(tuán)隊(duì)通過(guò)擾動(dòng)模擬，用IL-10刺激所產(chǎn)生scRNA-seq數(shù)據(jù)集富集分析推斷常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ChiP-seq數(shù)據(jù)中基因BLIMP-1和IRF1峰之間密切重疊，IRF1和PRDM1/14結(jié)合位點(diǎn)的顯著富集，提出了“IL10-STAT3-BLIMP-1信號(hào)軸可能是腫瘤相關(guān)T細(xì)胞耗竭的潛在驅(qū)動(dòng)因素”的假設(shè)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證猜想，作者對(duì)PRDM1進(jìn)行了計(jì)算機(jī)擾動(dòng)模擬驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤微環(huán)境中髓樣細(xì)胞分泌IL-10驅(qū)動(dòng)誘發(fā)T?細(xì)胞耗竭。

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序確定T?細(xì)胞的空間分布

為了確定?T?細(xì)胞簇的空間位置信息，以及與特定腫瘤狀態(tài)共定位信息，作者進(jìn)行了空間分辨轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序(stRNAseq)。該團(tuán)隊(duì)收集3名原發(fā)性GBM IDH1/2 Wt患者組織樣本，數(shù)據(jù)集總共包含2352個(gè)測(cè)序點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)的中位數(shù)為8個(gè)細(xì)胞（范圍：每個(gè)spot點(diǎn)捕獲4~22個(gè)細(xì)胞）。作者通過(guò)NMF回歸和Moran統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞簇與GBM亞型相關(guān)聯(lián)，腫瘤區(qū)域富集為間充質(zhì)樣腫瘤（MES樣），星形膠質(zhì)細(xì)胞樣（AC樣）轉(zhuǎn)錄特征與活化的CD8+效應(yīng)子、CD8+T耗盡簇共定位。

總之，這篇文章中作者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、擾動(dòng)模擬等手段，驗(yàn)證了空間上定位于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）間充質(zhì)樣亞群中的髓樣細(xì)胞分泌IL-10驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞耗竭，導(dǎo)致抑制性免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。這些研究成果對(duì)于臨床治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤疾病提供了新的治療方案。除此之外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序&空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在該研究中，起到了關(guān)鍵性作用。

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文章：Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells

期刊：Nature

影響因子：49.962

研究背景

結(jié)腸癌（CRC）是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)出便血、腹瀉、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體重減輕等全身癥狀。其發(fā)病率和病死率是僅次于肺癌的第三種惡性腫瘤疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)大約有20%患者被診斷出結(jié)直腸癌時(shí)，已經(jīng)處于癌癥晚期了，且結(jié)腸癌死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移和疾病復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)預(yù)測(cè)CRC疾病復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)的基因由腫瘤微環(huán)境(TME)的細(xì)胞表達(dá)，特別是癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)表達(dá)。因此，消除相關(guān)腫瘤細(xì)胞表達(dá)并預(yù)防結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)，是目前臨床診斷研究比較炙熱的關(guān)注點(diǎn)。2022年11月9日，來(lái)自西班牙巴塞羅那科學(xué)技術(shù)研究所的研究人員在Nature上一篇名為“Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells”的文章，該文首次發(fā)現(xiàn)了隱藏在肝臟和肺部中的殘余腫瘤細(xì)胞，并描述了它們?nèi)绾窝葑優(yōu)檫@些器官中出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移瘤。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定高復(fù)發(fā)細(xì)胞(HRCs)

該團(tuán)隊(duì)通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(scRNA-seq）手段，首先對(duì)CRC患者樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不良預(yù)后基因是由一群獨(dú)特的腫瘤細(xì)胞（包括：CAFs、內(nèi)皮細(xì)胞以及較小程度上髓系細(xì)胞）表達(dá)的，該團(tuán)隊(duì)將其命名為高復(fù)發(fā)細(xì)胞（high-relapsecells，HRCs）。

接著研究團(tuán)隊(duì)建立了CRC小鼠模型，模擬手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后發(fā)生轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的過(guò)程。發(fā)現(xiàn)原發(fā)性CRC手術(shù)后，小鼠肝臟中殘留的HRCs的增殖活動(dòng)很少，對(duì)原發(fā)性結(jié)腸癌的生長(zhǎng)沒(méi)有貢獻(xiàn)。但隨著時(shí)間的推移，殘留的HRCs會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞類(lèi)型，包括LGR5干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞。這群HRC細(xì)胞能夠脫離原發(fā)性結(jié)腸癌，遷移到血液中，到達(dá)肝臟，并在手術(shù)后隱藏一段時(shí)間，隨后引發(fā)明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移。

殘留的EMP1+細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)

為了找到結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的真正來(lái)源，研究人員借助人和小鼠模型，借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(scRNA-seq），發(fā)現(xiàn)EMP1在 HRCs細(xì)胞中高表達(dá)，且與EpiHR基因的表達(dá)有很大的重疊。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞消融實(shí)驗(yàn)，證明了導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)來(lái)源于殘留的EMP1陽(yáng)性細(xì)胞。

總之，這些研究成果對(duì)于臨床治療結(jié)直腸癌疾病提供了新的治療方案，這種新型的輔助免疫治療可預(yù)防結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)。除此之外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在該研究中，對(duì)腫瘤微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞之間異質(zhì)性、細(xì)胞亞型及狀態(tài)等研究方面，起到了關(guān)鍵性作用。

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標(biāo)題：Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM

發(fā)表雜志：EBioMedicine（IF=11.205）

發(fā)表時(shí)間：202209

研究背景

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是具有侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤類(lèi)型，通常對(duì)目前的治療具有耐藥性，以腫瘤微環(huán)境為中心的療法可能為GBM治療帶來(lái)新的希望。因此，迫切需要深入了解腫瘤-基質(zhì)通訊，以確定有希望的治療靶點(diǎn)。

研究方案設(shè)計(jì)

1、收集人、小鼠GBM的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial transcriptomics，ST）數(shù)據(jù)；

2、免疫細(xì)胞分選

1）小鼠脾臟T cells：EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ；

2）單核細(xì)胞：RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)沖洗股骨和脛骨，40μm濾器過(guò)濾，EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分選.；

3）CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells：anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。

3、流式分選：小鼠GBM細(xì)胞懸液抗體孵育30 mins，anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies對(duì)照；

4、免疫熒光：anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。

5、細(xì)胞共培養(yǎng)：前神經(jīng)元型膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新鮮分離的CD11b+ F4/80+巨噬細(xì)胞，每三天加入新鮮的巨噬細(xì)胞，持續(xù)的刺激后檢測(cè)間充質(zhì)表型的三種主要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（EPAS1、CEBPB、FOSL2）。

數(shù)據(jù)分析方法

1、scRNA-seq數(shù)據(jù)處理：Seurat，低質(zhì)量細(xì)胞過(guò)濾（a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA）、SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化、PCA降維（npcs=30）、細(xì)胞類(lèi)群識(shí)別FindNeighbors and FindClusters（resolution=0.8）、差異分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25)；

2、ST數(shù)據(jù)處理：Seurat 4.0，SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化、 PCA and UMAP降維聚類(lèi)（npcs=30）、SpatialFeaturePlot空間可視化；

3、腫瘤拷貝數(shù)據(jù)變異：inferCNV，過(guò)濾expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1；

4、細(xì)胞軌跡分析：Monocle 2，過(guò)濾expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200；

5、轉(zhuǎn)錄因子活性：SCIENCE，相關(guān)性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)

6、細(xì)胞通訊：Nichenet（Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test）、CytoTalk（分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes）

研究思路

研究結(jié)果

1、scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜

利用Seurat整合分析了來(lái)自不同數(shù)據(jù)集的scRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928），共獲得來(lái)自40例患者的54,534個(gè)細(xì)胞（圖1a）；利用inferCNV分析進(jìn)一步鑒別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞（圖1），與已發(fā)表的WES 數(shù)據(jù)一致；鑒定注釋到的惡性細(xì)胞包括：MES-like細(xì)胞（12.2%，CHI3L1、ADM）、AC-like細(xì)胞（36%，MLC1、HOPX）、NPC-like細(xì)胞（4.9%，CD24、DCX）和OPC-like細(xì)胞（26.4%，PDGFRA、OLIG1），非腫瘤細(xì)胞包括：巨噬細(xì)胞（8.2%，CD163、CD68）、小膠質(zhì)細(xì)胞（1.5%，CX3CR1、TMEM119）、淋巴細(xì)胞（0.7%，CD3D、NKG7）、內(nèi)皮細(xì)胞（1.1%，VWF、PECAM1）、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞（0.8%，COL1A2、BGN）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（4.3%，PTGDS、MBP）（圖1c-d）；GBM患者表現(xiàn)出高水平的瘤內(nèi)異質(zhì)性，尤其是腫瘤細(xì)胞（圖1E-F）；GSEA分析也驗(yàn)證了GBM的不同腫瘤細(xì)胞亞型（圖1g）。

圖1 scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜

2、軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

利用細(xì)胞軌跡分析，探索GBM不同腫瘤亞型間的分化關(guān)系，結(jié)果顯示擬時(shí)間線上主要由NPC-和OPC-like 腫瘤細(xì)胞逐漸分化為AC-和MES-like腫瘤細(xì)胞，同時(shí)有個(gè)小分支為AC-like腫瘤細(xì)胞，揭示了GBM的可塑性和前神經(jīng)元型（proneural, PN）到間質(zhì)型（mesenchymal, MES）的動(dòng)態(tài)過(guò)渡（圖2a-c）；PN與細(xì)胞周期、G2M檢查點(diǎn)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)的通路顯著富集，表明PN具有高度增殖性和可塑性，而MES與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、缺氧、ECM組織和細(xì)胞粘附相關(guān)的通路顯著富集（圖2d）；利用TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，與PN組相比，具有MES-like轉(zhuǎn)錄組特征的患者總生存期較差，而與MES-low組相比，MES-high組預(yù)后更差，表明具有間充質(zhì)特征的GBM患者的生存結(jié)局較差（圖2e）。Tips：利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的臨床數(shù)據(jù)，將單細(xì)胞數(shù)據(jù)中鑒定到關(guān)鍵maker基因或基因集進(jìn)行生存分析，是探討臨床意義的有效途徑。

利用SCENIC分析PN或MES細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC細(xì)胞中差異過(guò)表達(dá)，而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC細(xì)胞狀態(tài)中差異過(guò)表達(dá)，細(xì)胞軌跡分析證實(shí)了PN-MES轉(zhuǎn)換過(guò)程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下調(diào)（圖2k）。以上結(jié)果突出了從PN到MES細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變主要是由關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)的。

圖2 軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

3、PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析

利用MES基因特征將患者分為MES-high和MES-low組，發(fā)現(xiàn)MES-high組腫瘤微環(huán)境中伴有豐富的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3a, b）；但T細(xì)胞浸潤(rùn)在很多癌種的研究中與患者預(yù)后呈正相關(guān)，因此利用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，GBM MES亞型表達(dá)更高的T細(xì)胞和髓系細(xì)胞標(biāo)志物，并且T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖3c-d）；對(duì)空間scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CD8 + T細(xì)胞與CD68 +髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞共定位（圖3e），證實(shí)了T細(xì)胞與髓系細(xì)胞之間存在空間上的緊密接觸，可能發(fā)生在血管微環(huán)境中（vascular niches）。Tips：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組增加ST樣本，不僅能與單細(xì)胞數(shù)據(jù)互相驗(yàn)證，還能對(duì)maker基因和細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行空間定位，精準(zhǔn)鎖定有真實(shí)空間物理接觸的細(xì)胞間互作關(guān)系。

利用反卷積算法對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞豐度與巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞顯著相關(guān)，這是兩個(gè)主要的髓系細(xì)胞（圖3f）；利用流式細(xì)胞術(shù)，分析小鼠GBM中的免疫細(xì)胞，證實(shí)了T細(xì)胞與CD11b + F480 +腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）或CD11c + MHCII + DC顯著正相關(guān)（圖3g）。因此，間充質(zhì)亞型中T細(xì)胞比例較高主要是由于巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。

圖3 PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析

4、源自巨噬細(xì)胞的GPNMB有助于PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變

利用NicheNet分析腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間信號(hào)通訊，鑒定到了多個(gè)基質(zhì)細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互調(diào)控的配體-受體對(duì)，其中預(yù)測(cè)到巨噬細(xì)胞高表達(dá)的GPNMB與大多數(shù)間充質(zhì)靶標(biāo)存在相互作用（圖4a），GPNMB是一種跨膜糖蛋白，最初是在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，參與腫瘤遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移，通過(guò)直接抑制T細(xì)胞活化來(lái)逃避免疫；Tips：基于個(gè)性化分析結(jié)果，優(yōu)先篩選TOP基因（顯著性、差異倍數(shù)、靶標(biāo)基因數(shù)目等），結(jié)合研究領(lǐng)域內(nèi)已有特定功能報(bào)道的基因或通路，可以幫助更快鎖定目標(biāo)分子。

HPA和TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，GPNMB主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并且與巨噬細(xì)胞標(biāo)志物顯著正相關(guān)，這表明巨噬細(xì)胞是GPNMB的主要來(lái)源（圖4b, c），流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)了GPNMB主要在巨噬細(xì)胞上表達(dá)，而不是樹(shù)突狀或腫瘤細(xì)胞。Tips：流式細(xì)胞術(shù)是單細(xì)胞測(cè)序常見(jiàn)的下游驗(yàn)證方法，可用來(lái)分選目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)群、驗(yàn)證細(xì)胞比例的變化和新鑒定的maker基因作為特定細(xì)胞分選的可行性等。

GPNMB在MES亞型患者中高表達(dá)，并且與低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良相關(guān)（圖4d, e）；推測(cè)高表達(dá)GPNMB的巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向MES表型轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步利用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)，結(jié)果表明，長(zhǎng)期接觸巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并且靶向GPNMB的中和抗體治療可以部分消除這種作用，表明GPNMB是PN-MES狀態(tài)過(guò)渡的重要調(diào)節(jié)因子（圖4f）。

圖4 源自巨噬細(xì)胞的GPNMB有助于PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變

5、小鼠scRNA-seq分析單核細(xì)胞分化為Gpnmb-high巨噬細(xì)胞

收集小鼠GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)，重點(diǎn)關(guān)注在早期（d7）和晚期（d28）GBM小鼠的CD45 +免疫細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞maker基因表達(dá)鑒定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells（圖5a）；與以往的報(bào)道類(lèi)似，巨噬細(xì)胞隨著腫瘤進(jìn)展急劇侵入腫瘤部位，而小膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中逐漸消失（圖5b）；細(xì)胞軌跡分析推斷出樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞起源于單核細(xì)胞，并隨著腫瘤進(jìn)展而逐漸分化（圖5c）；不同的通路主導(dǎo)了腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的募集，單核細(xì)胞主要表達(dá)Cxcl10、Cxcl9、樹(shù)突狀細(xì)胞特異性表達(dá)Ccl17、Ccl22，而巨噬細(xì)胞表達(dá)Ccl24，Saa3、Arg1和Gpnmb僅在巨噬細(xì)胞中出現(xiàn)(圖5d）；在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，Arg1和Gpnmb的表達(dá)在巨噬細(xì)胞中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)（圖5e-g），這與人GBM數(shù)據(jù)集中的發(fā)現(xiàn)一致；然而，Gpnmb敲低后CD206（經(jīng)典M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)不變，提示GPNMB不是M2巨噬細(xì)胞極化的驅(qū)動(dòng)因素；免疫熒光染色顯示GPNMB+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共定位（圖5h），表明它們之間存在潛在的相互作用。

圖5 小鼠scRNA-seq分析單核細(xì)胞分化為Gpnmb-high巨噬細(xì)胞

6、GPNMB-high巨噬細(xì)胞影響DC激活T細(xì)胞

利用CytoTalk算法分析GBM中T細(xì)胞與APC-like細(xì)胞間的相互作用，研究完整的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果顯示，T細(xì)胞通過(guò)Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路與單核細(xì)胞、Gpnmb-high巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用，并且DC細(xì)胞與Gpnmb-high巨噬細(xì)胞共享Cxcl16-Cxcr6趨化因子信號(hào)與T細(xì)胞相互作用。為了驗(yàn)證Gpnmb-high巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，從GBM腫瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬細(xì)胞、D11c + DC和骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞，然后與na?ve T細(xì)胞共培養(yǎng)（圖6e）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與GPNMB+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，CD11c + DC共培養(yǎng)表達(dá)更高水平的CD69、IFNγ和GZMB，能更好地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化（圖6f）；T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果也表明，與GPNMB+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，CD11c + DC能顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖（圖6g）。綜合以上結(jié)果，確定了關(guān)鍵的GPNMB-high巨噬細(xì)胞亞群是GBM細(xì)胞間通訊的樞紐，不僅誘導(dǎo)PN-MES腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且通過(guò)與DC競(jìng)爭(zhēng)而損害T細(xì)胞激活。Tips：利用細(xì)胞通訊分析篩選潛在細(xì)胞間互作的受體-配體對(duì)，結(jié)合細(xì)胞共培養(yǎng)、co-IP和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)，可以探究目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型對(duì)特定細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。

圖6 GPNMB-high巨噬細(xì)胞影響DC激活T細(xì)胞

研究總結(jié)

1、本文通過(guò)scRNA-seq數(shù)據(jù)將高度異質(zhì)性的GBM腫瘤細(xì)胞分為MES-like、AC-like，OPC-like和NPC-like亞型；

2、利用細(xì)胞軌跡分析和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)到由特定TF調(diào)節(jié)的PN到MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換；

3、利用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、細(xì)胞通訊分析，鎖定到了關(guān)鍵的GPNMB-high巨噬細(xì)胞，在PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用；

4、通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析和細(xì)胞共培養(yǎng)研究，進(jìn)一步揭示了這些源自單核細(xì)胞的GPNMB高巨噬細(xì)胞亞群可能無(wú)效地保留T細(xì)胞不被樹(shù)突狀細(xì)胞激活，提示未來(lái)靶向GPNMB-high巨噬細(xì)胞的聯(lián)合免疫治療可作為有潛力的治療策略。

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單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)個(gè)性化分析方法

單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的挖掘方向復(fù)雜多樣，針對(duì)不同領(lǐng)域的生物學(xué)表型和機(jī)理研究，需要持續(xù)不斷地開(kāi)發(fā)個(gè)性化分析內(nèi)容，從不同的角度進(jìn)行個(gè)性化數(shù)據(jù)挖掘，以下就是單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)個(gè)性化分析的幾個(gè)分析方向：

1、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：細(xì)胞軌跡分析–揭示細(xì)胞發(fā)育分化動(dòng)態(tài)軌跡

細(xì)胞軌跡分析可以在單細(xì)胞分辨率驗(yàn)證已知的細(xì)胞分化關(guān)系，推斷未知的細(xì)胞分化路徑，挖掘一些稀少的中間狀態(tài)細(xì)胞，解析細(xì)胞分化過(guò)程中的起調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，在發(fā)育生物學(xué)中細(xì)胞分化、譜系發(fā)育研究方向、腫瘤/疾病微環(huán)境中免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化研究中均有廣泛應(yīng)用。目前進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析的方法和軟件非常之多，大致可以概括為兩種方法，一種是以monocle軟件為代表的擬時(shí)序分析（pseudotime analysis），另一種則是以velocyto /scVelo為主的RNA速度分析（RNA velocity）。詳情>>單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析沒(méi)有思路？試試細(xì)胞軌跡分析~(內(nèi)附代碼)

2、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：細(xì)胞通訊分析–解析細(xì)胞間的信號(hào)通訊關(guān)系

多細(xì)胞生物是由很多不同類(lèi)型細(xì)胞組成的開(kāi)放而復(fù)雜體系，配體受體復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊對(duì)協(xié)調(diào)發(fā)育、分化和炎癥等多種生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要。細(xì)胞通訊分析，又稱(chēng)細(xì)胞受體-配體互作分析，是以細(xì)胞亞群的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)為研究對(duì)象，通過(guò)獲得細(xì)胞中配體及受體基因的表達(dá)信息，比較細(xì)胞類(lèi)型之間的配體與受體基因表達(dá)差異，分析得到細(xì)胞亞群間的信號(hào)通訊關(guān)系，在闡明生物學(xué)過(guò)程中細(xì)胞間通訊的復(fù)雜性、多樣性和動(dòng)態(tài)性方面有重要意義。

3、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：GSEA/GSVA分析–基于功能基因集的富集分析策略

GSEA( Gene Set Enrichment Analysis)，是2005年由Broad Institute研究開(kāi)發(fā)的一種基于基因集的富集分析方法，用來(lái)評(píng)估一個(gè)預(yù)先定義的基因集的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢(shì)，從而判斷其對(duì)表型的貢獻(xiàn)。GSEA是從所有基因的表達(dá)豐度出發(fā)，分析在不同的通路中的基因的整體表達(dá)影響，這也是區(qū)別于GO/KEGG富集分析的地方，GSEA不需要設(shè)定差異閾值篩選目標(biāo)基因集，理論上更容易囊括細(xì)微但協(xié)調(diào)性的變化對(duì)生物通路的影響。Broad研究所在GSEA發(fā)布8年之后，開(kāi)發(fā)了GSVA（Gene Set Variation Analysis）算法來(lái)拓展基因集分析的應(yīng)用。GSEA分析主要用于兩兩組間比較的方案設(shè)計(jì)中，對(duì)于分組比較復(fù)雜的方案設(shè)計(jì)則比較適合GSVA分析，GSVA不需要預(yù)先進(jìn)行樣本之間的差異分析，依據(jù)表達(dá)矩陣就可以計(jì)算每個(gè)樣本中特定基因集的變異分?jǐn)?shù)。

4、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：腫瘤拷貝數(shù)變異分析–揭示惡性細(xì)胞表型

拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的，基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，基因組結(jié)構(gòu)變異(Structural variation, SV) 的重要組成部分，也是人類(lèi)疾病的重要致病因素之一。與正常細(xì)胞相比，腫瘤基因組部分區(qū)域呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)，通過(guò)與一組參考的“正?！奔?xì)胞相比，比較不同樣本間或不同細(xì)胞類(lèi)型之間的CNV基因表達(dá)差異，探索腫瘤基因組位置上基因的表達(dá)強(qiáng)度，最終反映基因大片段區(qū)域的CNV事件，鑒定體細(xì)胞整個(gè)染色體或大片段染色體的擴(kuò)增或缺失。

5、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：轉(zhuǎn)錄因子活性分析–挖掘關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子

單細(xì)胞研究通常會(huì)涉及到一個(gè)核心關(guān)鍵問(wèn)題：細(xì)胞的異質(zhì)性以及這種異質(zhì)性是如何發(fā)展和維持的。這種細(xì)胞異質(zhì)性很大程度上是由潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定的，特定轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）集合的協(xié)同表達(dá)驅(qū)動(dòng)各自靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而建立特定的基因表達(dá)譜。因此，單細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于深入挖掘細(xì)胞異質(zhì)性背后的生物學(xué)意義是至關(guān)重要的。利用pySCENIC從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推斷TF、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞類(lèi)型，基本原理是基于共表達(dá)和DNA調(diào)控保守序列（motif）分析推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，然后在每個(gè)細(xì)胞中分析網(wǎng)絡(luò)活性以鑒定細(xì)胞狀態(tài)。

6:、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析–篩選表型相關(guān)核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）是構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的常用方法，可以探索模塊與特定表型或疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系,最終達(dá)到鑒定基因網(wǎng)絡(luò)的目的；單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以揭示特定腫瘤組織中的細(xì)胞特異性，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，并且識(shí)別特定的標(biāo)志物，但其檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量和病例來(lái)源都是有限的。利用WGCNA分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，可以提供一套有別于高変基因、差異分析的方法，不依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)直接用表達(dá)量的相關(guān)性值預(yù)測(cè)調(diào)控關(guān)系，篩選某些細(xì)胞亞群中有關(guān)聯(lián)作用的基因集（稱(chēng)為模塊），可以從成千上萬(wàn)的基因中挑選出高度相關(guān)的基因的模塊，并將模塊與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，尋找marker gene或治療靶點(diǎn)。

7、單細(xì)胞測(cè)序個(gè)性化分析方法：單細(xì)胞空間聯(lián)合分析-解析空間結(jié)構(gòu)異質(zhì)性

基因表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組主要從時(shí)間上研究基因表達(dá)，能夠系統(tǒng)的識(shí)別組織中的細(xì)胞亞群，但沒(méi)有捕獲其空間組織信息，限制了我們對(duì)組織及細(xì)胞間相互作用的理解。而空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用使得人們能夠從空間的角度解析數(shù)據(jù)，在空間上研究基因的表達(dá)。通過(guò)整合兩種數(shù)據(jù)模式，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，在時(shí)空上分析基因的表達(dá)具有重要的意義。

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發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表單位：柏林醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所

影響因子：41.307

發(fā)表時(shí)間：2022.07.21

DOI號(hào)：10.1038/s41588-022-01129-5

成年哺乳動(dòng)物的心臟損傷通常會(huì)導(dǎo)致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚(yú)心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚(yú)成為研究心臟再生細(xì)胞和分子機(jī)制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫?fù)p傷后，受傷的斑馬魚(yú)心臟會(huì)經(jīng)歷一個(gè)短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會(huì)通過(guò)去分化和增殖進(jìn)行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚(yú)心臟再生研究中，還沒(méi)有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)來(lái)確定再生細(xì)胞的狀態(tài)和細(xì)胞類(lèi)型的起源，對(duì)再生生態(tài)位的細(xì)胞組成、潛在的信號(hào)傳遞和相互作用的認(rèn)識(shí)仍不全面。目前對(duì)活化巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的定義嚴(yán)重依賴于轉(zhuǎn)基因，可能受到觀察偏差的影響，從而低估斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中細(xì)胞狀態(tài)的復(fù)雜性。

單細(xì)胞RNA-seq ：

表1 實(shí)驗(yàn)樣本一覽表

空間轉(zhuǎn)錄組（Tomo-seq）：斑馬魚(yú)心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq

方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術(shù)的譜系追蹤

為了系統(tǒng)地識(shí)別健康和再生斑馬魚(yú)心臟中的細(xì)胞類(lèi)型，作者對(duì)損傷前后不同階段的大約20萬(wàn)個(gè)解離細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq（圖1a）。為了準(zhǔn)確得到細(xì)胞發(fā)育起源的相關(guān)信息，作者還應(yīng)用了一種基于CRISPR–Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法，通過(guò)注射Cas9和針對(duì)多拷貝轉(zhuǎn)基因(斑馬魚(yú)系中的dTomato：一種用于斑馬魚(yú)細(xì)胞追蹤和譜系分析的多光譜細(xì)胞標(biāo)記)的sgRNA，創(chuàng)建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來(lái)記錄早期發(fā)育中的譜系關(guān)系。

作者首先評(píng)估了健康和再生心臟中的細(xì)胞類(lèi)型多樣性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聚類(lèi)分析顯示了所有主要的心臟細(xì)胞類(lèi)型。正如預(yù)期的那樣，觀察到成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞在損傷后強(qiáng)烈增加（圖1b）。進(jìn)一步檢查聚類(lèi)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，心臟的三個(gè)主要層:心外膜、心肌和心內(nèi)膜的細(xì)胞類(lèi)型之間存在一個(gè)亞結(jié)構(gòu)。作者假設(shè)，由于心房和心室中這些細(xì)胞類(lèi)型的功能差別，這種細(xì)胞類(lèi)型的亞結(jié)構(gòu)可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機(jī)沿感興趣的軸對(duì)組織進(jìn)行切片，然后在每個(gè)切片上進(jìn)行RNA-seq的技術(shù)）進(jìn)行空間分辨率轉(zhuǎn)錄組，并將空間數(shù)據(jù)解卷積為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜，可以驗(yàn)證一些細(xì)胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過(guò)物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖1d）。

圖1?再生心臟的細(xì)胞組成

作者進(jìn)一步確定了心肌細(xì)胞中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄亞結(jié)構(gòu)（圖2a）。除了以表達(dá)ATP合成和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細(xì)胞外，還檢測(cè)到一個(gè)較小的與心肌細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區(qū)去分化心肌細(xì)胞的標(biāo)記基因。這些去分化心肌細(xì)胞是心臟再生的標(biāo)志，其數(shù)量在3 d.p.i.（受傷后天數(shù)）增加了(圖2a)，并與已建立的標(biāo)記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。

作者注意到心臟再生中三個(gè)成熟的信號(hào)因子在成纖維細(xì)胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細(xì)胞有絲分裂原nrg1和再生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細(xì)地研究心臟成纖維細(xì)胞的多樣性，作者對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚類(lèi)。結(jié)果顯示出驚人的多樣性，有13個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的成纖維細(xì)胞聚類(lèi)(圖2c)。這13個(gè)基因簇在ECM相關(guān)基因的表達(dá)譜上表現(xiàn)出明顯的差異（圖2d），但它們的轉(zhuǎn)錄組多樣性遠(yuǎn)不止于此——去除ECM相關(guān)基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細(xì)胞亞型。

圖2?心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型多樣性

3. 心臟再生成纖維細(xì)胞的鑒定

為了集中分析那些可能是再生生態(tài)位一部分的成纖維細(xì)胞亞型，作者分析了損傷后細(xì)胞簇的動(dòng)力學(xué)。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達(dá)的3簇成纖維細(xì)胞在再生高峰期短暫出現(xiàn)?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個(gè)基因簇稱(chēng)為細(xì)胞狀態(tài)，而不是細(xì)胞類(lèi)型（圖3a）。為了對(duì)鑒定的成纖維細(xì)胞進(jìn)行空間分辨，作者進(jìn)行了熒光原位雜交證實(shí)了瞬時(shí)成纖維細(xì)胞狀態(tài)在邊界區(qū)以及損傷區(qū)的位置（圖3b）。之后發(fā)現(xiàn)nrg1在col12a1a成纖維細(xì)胞中特別高的表達(dá)，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖3c）。作者推斷瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的潛在再生功能可能是由分泌因子驅(qū)動(dòng)的。生物信息學(xué)分析顯示，與未損傷的對(duì)照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達(dá)在3 d.p.i.和7 d.p.i.時(shí)增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞中分泌組基因的表達(dá)在所有檢測(cè)到的細(xì)胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態(tài)發(fā)生和組織發(fā)育等方面具有功能的基因（圖3e）。

雖然作者對(duì)單細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)空分析強(qiáng)烈表明了瞬時(shí)成纖維細(xì)胞的再生功能，但還需要額外的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)。為了從功能上評(píng)估瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統(tǒng)進(jìn)行靶向細(xì)胞剔除。在MTZ處理后的轉(zhuǎn)基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時(shí)相較于對(duì)照，5 / 6的心臟顯示心肌細(xì)胞增殖減少，col12aa表達(dá)細(xì)胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時(shí)，col12a1⁺細(xì)胞剔除顯著損害心臟再生（圖3i,j）?？傊髡叽_定了心臟再生過(guò)程中具有潛在再生作用的三種成纖維細(xì)胞狀態(tài):col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細(xì)胞?；蚣?xì)胞剔除數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明col12a1a表達(dá)細(xì)胞在再生生態(tài)位中發(fā)揮了作用。

圖3?心臟再生成纖維細(xì)胞的鑒定

4. 心外膜成纖維細(xì)胞的鑒定

接下來(lái)，作者想要闡明短暫成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，以便更好地理解它們的激活機(jī)制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細(xì)胞通過(guò)可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標(biāo)記，它們由Cas9在早期發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生，其獨(dú)特的序列能夠識(shí)別疤痕產(chǎn)生時(shí)來(lái)自同一親本的細(xì)胞。通過(guò)對(duì)同一個(gè)單細(xì)胞的遺傳疤痕和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，作者便可以建立譜系樹(shù)，揭示這些細(xì)胞類(lèi)型的共同發(fā)育起源（圖4a）。在譜系樹(shù)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)中的所有細(xì)胞共享相同的發(fā)育祖先（比如圖4a，B和C節(jié)點(diǎn)就共享相同發(fā)育祖先A），并且每個(gè)節(jié)點(diǎn)上不同瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)下的每個(gè)細(xì)胞均可在相同的上一節(jié)點(diǎn)中對(duì)應(yīng)找到（比如在圖4a的譜系圖中節(jié)點(diǎn)C就包含了3種瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，這三種狀態(tài)下的所有細(xì)胞均可以在上一節(jié)點(diǎn)的對(duì)應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)中找到）。作者還計(jì)算了不同樹(shù)節(jié)點(diǎn)中細(xì)胞類(lèi)型比率之間的相關(guān)性，以確定哪些細(xì)胞類(lèi)型通過(guò)譜系相關(guān)聯(lián)（圖4b）。譜系相關(guān)性聚類(lèi)熱圖顯示，在3 d.p.i.時(shí)有4簇細(xì)胞類(lèi)型，在7 d.p.i.時(shí)有7簇細(xì)胞類(lèi)型。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，所有的免疫細(xì)胞共享一個(gè)相同的譜系。此外，幾種成纖維細(xì)胞：col11a1a、col12a1a和構(gòu)成型成纖維細(xì)胞，它們和心外膜細(xì)胞聚集在一起，這表明這些成纖維細(xì)胞與心外膜細(xì)胞具有共同的發(fā)育起源（圖4c,d）。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，作者又構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達(dá)的mCherry與內(nèi)源性表達(dá)的col12a1a共定位（圖4e），證實(shí)了瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細(xì)胞的起源。為了進(jìn)一步闡明短暫心外膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，作者應(yīng)用了RNA速度分析方法，對(duì)心外膜譜系簇中所有心室細(xì)胞類(lèi)型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發(fā)育軌跡進(jìn)行推斷（圖4f），得到了相同的結(jié)論。

圖4?心外膜成纖維細(xì)胞的鑒定

5. 心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的鑒定

瞬時(shí)nppc成纖維細(xì)胞和其他幾個(gè)成纖維細(xì)胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細(xì)胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時(shí)不屬于心外膜譜系，但與心內(nèi)膜以及彼此之間顯示中度正相關(guān)?；谙嚓P(guān)性的分析有一個(gè)潛在的假設(shè)，即所有克隆體都會(huì)表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)換率（圖5a），但是這種假設(shè)并不適用于所有細(xì)胞類(lèi)型，于是作者引入條件概率開(kāi)發(fā)了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時(shí)，不同成纖維細(xì)胞類(lèi)型：col11a1a成纖維細(xì)胞、構(gòu)成型成纖維細(xì)胞、心外膜(心室)轉(zhuǎn)變?yōu)?em>col12a1a成纖維細(xì)胞類(lèi)型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時(shí)，不同的心內(nèi)膜細(xì)胞類(lèi)型：心內(nèi)膜（心房）、心內(nèi)膜（心室）和心內(nèi)膜 ( frzb )轉(zhuǎn)變?yōu)?em>nppc成纖維細(xì)胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細(xì)胞類(lèi)型與心內(nèi)膜之間存在譜系關(guān)系。為了驗(yàn)證算法的真實(shí)性，作者構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達(dá)的EGFP與內(nèi)源性表達(dá)的nppc共定位（圖5e），證實(shí)了瞬時(shí)nppc成纖維細(xì)胞的心內(nèi)膜起源。RNA速度分析揭示了心室內(nèi)膜和nppc成纖維細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性和潛在的過(guò)渡路徑（圖5f）。從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到，與健康對(duì)照組心臟相比，心內(nèi)膜在7 d.p.i.時(shí)發(fā)生了激活反應(yīng)（圖5g）。

圖5?心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的鑒定

6. 典型Wnt信號(hào)通路作用的細(xì)胞解剖

作者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中表達(dá)了許多與Wnt信號(hào)有關(guān)的基因(配體、受體和調(diào)節(jié)劑)（圖6a），于是這啟發(fā)了他們?nèi)パ芯縒nt信號(hào)在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中的作用。一方面，Wnt通常被認(rèn)為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對(duì)斑馬魚(yú)鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號(hào)通路在心肌細(xì)胞去分化和增殖中的作用存在爭(zhēng)議。于是，作者在斑馬魚(yú)心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴的信號(hào)抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號(hào)，并在3,7,15和30 d.p.i.觀察其影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制導(dǎo)致心臟再生顯著延遲，與對(duì)照組相比，心肌纖維化延長(zhǎng)，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示心肌細(xì)胞去分化延遲，與對(duì)照組相比，去分化心肌細(xì)胞數(shù)量在3 d.p.i.時(shí)減少，而在7 d.p.i.時(shí)未定位于損傷區(qū)域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細(xì)胞和所有心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細(xì)胞)的水平顯著降低，而其他短暫增加的成纖維細(xì)胞總體上保持在類(lèi)似水平（圖6d）。通過(guò)熒光原位雜交也證實(shí)了，Wnt信號(hào)對(duì)于心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的激活是必需的，類(lèi)似于所描述的Wnt在誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。

為了評(píng)估血管再生，作者對(duì)4d.p.i.下冠脈內(nèi)皮細(xì)胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區(qū)冠狀動(dòng)脈的覆蓋范圍進(jìn)行了定量分析。發(fā)現(xiàn)注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時(shí)有邊緣但不顯著的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時(shí)，損傷區(qū)冠狀動(dòng)脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結(jié)果表明，Wnt抑制后觀察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導(dǎo)的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關(guān)。

圖6 對(duì)典型Wnt信號(hào)作用的細(xì)胞剖析

成年斑馬魚(yú)心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態(tài)位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和時(shí)空分析，解剖了再生斑馬魚(yú)心臟中激活細(xì)胞狀態(tài)的多樣性。觀察到損傷后出現(xiàn)的幾種具有成纖維細(xì)胞特征的瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，并概述了表達(dá)膠原-12的成纖維細(xì)胞的促再生功能。為了了解導(dǎo)致心臟再生的級(jí)聯(lián)事件，作者通過(guò)高通量譜系追蹤確定了這些細(xì)胞狀態(tài)的起源。最終發(fā)現(xiàn)激活的成纖維細(xì)胞有兩個(gè)不同的來(lái)源:心外膜和心內(nèi)膜。在機(jī)制上，確定Wnt信號(hào)作為心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)器?？傊?，本文確定了促進(jìn)心臟再生的特殊活化成纖維細(xì)胞狀態(tài)，從而為調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物心臟再生能力開(kāi)辟了可能的途徑。

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參考文獻(xiàn)

今天跟大家分享一篇少量樣本結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析的研究報(bào)道，“彌漫性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎微環(huán)境中免疫細(xì)胞基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”，該文是百邁客合作客戶青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院宋西成教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Frontiers?in?Immunology（IF=8.786）的研究成果，發(fā)表時(shí)間為2022年5月。百邁客為該研究提供了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組和代謝組的建庫(kù)測(cè)序服務(wù)。

研究背景

人類(lèi)自身免疫性甲狀腺疾病?(AITD)?是最常見(jiàn)的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺功能障礙和非地方性甲狀腺腫的最常見(jiàn)原因，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫（Graves’disease，GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s?thyroiditis，HT）；HT和GD具有不同的臨床特征，但它們?cè)诮M織損傷方面是相似的，包括體內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。研究表明，T淋巴細(xì)胞及其特異性細(xì)胞因子作為免疫不可或缺的組成部分，在AITD的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和輔助T細(xì)胞17?(Th17)的失調(diào)、Th1/Th2失衡在AITD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，但這些細(xì)胞亞群免疫功能障礙引起的致病分子機(jī)制在很大程度上仍未得到解釋。

本研究基于HT患者、GD患者和健康對(duì)照甲狀腺組織的單細(xì)胞RNA測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和代謝組測(cè)序數(shù)據(jù)，探討了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常的免疫細(xì)胞，構(gòu)建了免疫細(xì)胞的全局調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步了解HT和GD免疫紊亂和代謝異常介導(dǎo)的疾病機(jī)制、更好地干預(yù)和治療疾病提供了科學(xué)的理論指導(dǎo)和研究基礎(chǔ)。

研究思路

主要內(nèi)容

1、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析HT和GD的異常表達(dá)基因

為了鑒定HT組和GD組中異常表達(dá)的lncRNA和miRNA，分別進(jìn)行了ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，共檢測(cè)到6,153?個(gè)?lncRNA?s和?741?個(gè)?miRNAs?在?HT?患者中存在差異表達(dá)（圖?1A）；GD患者中檢測(cè)到5,492個(gè)lncRNAs?和?165?個(gè)?miRNAs?存在差異表達(dá)（圖?1B）；相關(guān)性分析結(jié)果驗(yàn)證了本研究中兩種測(cè)序方法的檢測(cè)穩(wěn)定性（圖?1C,?D）。

圖1?HT和GD基因表達(dá)差異分析

2、HT和GD基因表達(dá)差異與異常免疫級(jí)聯(lián)和代謝信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)

對(duì)HT組和GD組顯著差異基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示，HT組中顯著富集的通路為白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、T?細(xì)胞活化和分化、細(xì)胞因子代謝過(guò)程和免疫反應(yīng)激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖?2A），而GD組中，則顯著富集的信號(hào)通路為白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、激素代謝過(guò)程和的細(xì)胞趨化性（圖?2B）；此外，HT（圖?2C）和GD（圖?2D）均富含與甲狀腺疾病相關(guān)的信號(hào)通路，包括甲狀旁腺激素合成、甲狀腺激素分泌、甲狀腺激素信號(hào)通路作用和自身免疫性甲狀腺疾??；同時(shí)，HT和GD還富集了其他幾種免疫炎癥和代謝信號(hào)相關(guān)通路，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、NF-kappa?B信號(hào)通路、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。

為了進(jìn)一步確定代謝物在HT和GD中的作用，對(duì)HT組、GD組及對(duì)照組的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異代謝物分析及代謝通路富集分析（圖?2E,?F）。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝和類(lèi)固醇生物合成的代謝通路在HT組中顯著激活（圖?2G(a)），而亞油酸代謝和類(lèi)固醇激素生物合成代謝通路受到抑制（圖?2G(b)）；此外，類(lèi)固醇激素生物合成、咖啡因代謝和花生四烯酸代謝通路在GD組中被激活（圖?2G(c)），而苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亞油酸代謝通路受到抑制（圖?2G(d)）。

鑒于免疫反應(yīng)在HT和GD中的重要作用，利用GSEA方法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，進(jìn)一步評(píng)估了樣本中免疫細(xì)胞的豐度，發(fā)現(xiàn)CD4?+T細(xì)胞、CD8?+?T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Th1和Th2細(xì)胞均有不同程度的浸潤(rùn)（圖?2H）。

圖2?HT和GD中失調(diào)的基因表達(dá)與異常的免疫級(jí)聯(lián)和代謝信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)

3、HT和GD中疾病微環(huán)境中CD4+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常

對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD4+?T細(xì)胞亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對(duì)照組中細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?3A）。將bulk?RNA-seq數(shù)據(jù)中顯著差異表達(dá)的基因，與CD4+??T細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因取交集，并對(duì)這些共表達(dá)的基因集進(jìn)行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組中顯著差異富集的通路有甲狀腺激素信號(hào)通路、T?細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和NF-kappa?B信號(hào)通路（圖?3B）；而在GD組中，甲狀旁腺激素合成，分泌和作用、ECM-受體相互作用、嘌呤代謝、cAMP?信號(hào)通路、NF-kappa?B?信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號(hào)通路顯著富集（圖?3C?)。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號(hào)通路顯著富集（圖?3D），但GD組中未觀察到顯著富集的通路。此外，氨基酸生物合成和嘌呤代謝相關(guān)的代謝通路在HT和GD組中均顯著富集。

圖3?HT和GD微環(huán)境CD4+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常

4、HT和GD疾病微環(huán)境中CD8+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常

對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+??T細(xì)胞亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對(duì)照組中細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?4A）；與CD8+?T細(xì)胞亞群類(lèi)似，將與bulk數(shù)據(jù)中共表達(dá)的基因集進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果顯示，在HT（圖?4B）和GD（圖?4C）中，顯著富集的通路有抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號(hào)通路；甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用及白細(xì)胞跨內(nèi)的遷移途徑在HT組顯著富集；而GD組中，嘌呤代謝和cAMP信號(hào)通路顯著富集。GSEA分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號(hào)通路顯著富集（圖?4D），而在GD組中未發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路；嘌呤代謝信號(hào)通路在HT組和GD組中均富集。

圖4?HT和GD微環(huán)境CD8+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常

5、HT和GD微環(huán)境巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常

對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+?T細(xì)胞亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)?HT、GD?和對(duì)照組中巨噬細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?5A）。同樣地，將與bulk數(shù)據(jù)共表達(dá)的基因集進(jìn)行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組（圖?5B）和GD組（圖?5C）顯著富集的信號(hào)通路有甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用、抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號(hào)通路、NF-kappa?B信號(hào)通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；T組中，甲狀腺激素信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路顯著富集；GD組中，吞噬體、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑顯著富集。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NF-kappa?B信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化以及Th17細(xì)胞分化通路顯著富集（圖?5D)，而GD組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的富集通路；嘌呤和苯丙氨酸代謝信號(hào)通路分別在HT組和GD組中顯著富集。

圖5?HT和GD微環(huán)境巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常

6、HT和GD微環(huán)境中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為了確定HT和GD疾病微環(huán)境的細(xì)胞間調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)CD4+?T細(xì)胞、CD8+?T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行iTALK細(xì)胞通訊分析。分析結(jié)果顯示，HT（圖?6A）和GD（圖?6B）中配體-受體對(duì)的豐度存在顯著差異；HT組中，微環(huán)境中的T細(xì)胞主要通過(guò)IL16-CCR5、FGF10-FGFR1、CXCL13-CXCR3和CD70-CD27受體配體對(duì)靶向巨噬細(xì)胞，激活細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號(hào)通路（圖?6C）；GD組中，微環(huán)境T細(xì)胞主要通過(guò)CXCR3-CXCL10、PKM-CD44和?CCL21-CCR7受體配體對(duì)靶向巨噬細(xì)胞，激活EMC受體相互作用和NF-kappa?B信號(hào)通路（圖?6D）；相較于對(duì)照相，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（CCL21、CCR7、CD4、CD27、CD70、CXCL13、ICOS、IL-16、LAT、TNF及IL16），經(jīng)qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在HT組?(圖?6E?)?和GD?(圖?6F?)均顯示存在顯著差異表達(dá)。

圖6?HT和GD疾病微環(huán)境T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

研究小結(jié)

本研究利用轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的測(cè)序數(shù)據(jù)聯(lián)合，在單細(xì)胞水平上鑒定了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號(hào)異常的免疫細(xì)胞；同時(shí)，構(gòu)建了免疫細(xì)胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為HT和GD疾病機(jī)制介導(dǎo)的免疫失調(diào)和代謝異常提供了新的視角。

參考文獻(xiàn)

Zheng,?Haitao?et?al.?“A?Global?Regulatory?Network?for?Dysregulated?Gene?Expression?and?Abnormal?Metabolic?Signaling?in?Immune?Cells?in?the?Microenvironment?of?Graves’?Disease?and?Hashimoto’s?Thyroiditis.”?Frontiers?in?immunology?vol.?13?879824.?26?May.?2022,?doi:10.3389/fimmu.2022.879824

2月，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)繼續(xù)為腫瘤、疾病、發(fā)育、免疫等生物學(xué)問(wèn)題的深入探索帶來(lái)新的突破。本期為大家介紹2月國(guó)內(nèi)學(xué)者借助單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在發(fā)育研究方面新的探索與發(fā)現(xiàn)，希望這些研究能為更多的科研工作者帶來(lái)關(guān)于利用前沿技術(shù)深入解析胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化等研究帶來(lái)思考和啟發(fā)。

2月1日，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Cell?Mol?Gastroenterol?Hepatol》（IF=7.076）在線發(fā)表了題為“Notch調(diào)節(jié)的c-kit陽(yáng)性肝竇內(nèi)皮細(xì)胞有助于肝臟分區(qū)和再生”的研究成果。該研究通過(guò)建立PHx小鼠模型誘導(dǎo)肝再生，并對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（SECs）?進(jìn)行單細(xì)胞?RNA?測(cè)序，發(fā)現(xiàn)c-kit+SECs?通過(guò)Wnt2促進(jìn)肝臟分區(qū)和再生，并受?Notch?信號(hào)調(diào)節(jié)。（DOI:10.1016/j.jcmgh.2022.01.019）

2月3日，中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所的研究團(tuán)隊(duì)在《Genomics?Proteomics?Bioinformatics》（IF=7.051）發(fā)表了題為“單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性”的研究成果。該研究通過(guò)對(duì)源自骨髓和沃頓氏膠的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）?進(jìn)行單細(xì)胞?RNA測(cè)序，繪制了這五個(gè)MSC亞群的發(fā)育軌跡，并確定了兩個(gè)在自我更新和免疫調(diào)節(jié)方面具有潛在功能的亞群。（DOI:10.1016/j.gpb.2022.01.005）

2月4日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Front?Immunol》（IF=5.085）發(fā)表了題為“CCR2巨噬細(xì)胞促進(jìn)正畸牙齒運(yùn)動(dòng)和牙槽骨重塑”的研究成果。該研究利用單細(xì)胞RNA測(cè)序研究牙槽骨重塑過(guò)程中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)機(jī)械力誘導(dǎo)的由?NF-κB通路介導(dǎo)的Ccr2巨噬細(xì)胞簇的功能轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致促炎反應(yīng)和骨重塑。（DOI:10.3389/fimmu.2022.835986）

2月4日，上海交通大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《New?Phytol》（IF=8.512）發(fā)表了題為“水稻單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜定義了水稻小花和花序分生組織的發(fā)育軌跡”的研究成果。該研究使用單細(xì)胞?RNA?測(cè)序?qū)λ净ㄐ蜻M(jìn)行分析，構(gòu)建了涵蓋早期生殖發(fā)育過(guò)程中花序到小花轉(zhuǎn)變的基因組規(guī)模的基因表達(dá)資源，重建了小花和腋生分生組織的分化軌跡，鑒定了高度異質(zhì)性年輕花序中的離散細(xì)胞類(lèi)型和調(diào)節(jié)因子組，并通過(guò)原位雜交和熒光標(biāo)記線進(jìn)行驗(yàn)證。（DOI:10.1111/nph.18008）

2月8日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Neuron》（IF=14.415）發(fā)表了題為“神經(jīng)源性神經(jīng)肽Y微調(diào)脾免疫反應(yīng)”的研究成果。該研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)敲除大鼠腎上和腹腔神經(jīng)節(jié)（SrG-CG）中的?NPY?基因改變了脾淋巴細(xì)胞的增殖和活化，證明了NPY是一種用于神經(jīng)免疫系統(tǒng)串?dāng)_的古老語(yǔ)言，可用于緩解感染期間的炎癥風(fēng)暴和調(diào)節(jié)自身免疫性疾病中的免疫平衡。（DOI:10.1016/j.neuron.2022.01.010）

2月15日，河南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Plant?Cell》（IF=9.618）發(fā)表了題為“玉米單核轉(zhuǎn)錄組全面描述了控制草氣孔運(yùn)動(dòng)和發(fā)育的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)”的研究成果。該研究開(kāi)發(fā)了植物單核RNA測(cè)序平臺(tái)，并用它鑒定玉米表皮中成熟和發(fā)育氣孔的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在氣孔發(fā)育和啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞形成中保衛(wèi)細(xì)胞和輔助細(xì)胞之間存在更復(fù)雜的關(guān)系，證實(shí)了已知特征并闡明了氣孔發(fā)育的關(guān)鍵參與者。（DOI:10.1093/plcell/koac047）

2月22日，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Proc?Natl?Acad?Sci?USA》（IF=9.412）發(fā)表了題為“以單細(xì)胞分辨率破譯人類(lèi)薄子宮內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜生態(tài)位”的研究成果。該研究利用單細(xì)胞RNA測(cè)序表征人類(lèi)子宮內(nèi)膜的細(xì)胞類(lèi)型、它們的通訊以及增殖期正常和薄子宮內(nèi)膜中子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的潛在機(jī)制，提供了對(duì)子宮內(nèi)膜再生和生長(zhǎng)治療薄子宮內(nèi)膜的治療策略的見(jiàn)解。（DOI:10.1073/pnas.2115912119）

2月23日，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)在《Adv?Sci》（IF=15.84）發(fā)表了題為“發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)椎間盤(pán)穩(wěn)態(tài)和退化至關(guān)重要的產(chǎn)后髓核祖細(xì)胞”的研究成果。該研究對(duì)髓核（NP）進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，構(gòu)建了一個(gè)新的NP細(xì)胞圖譜，確定了具有再生潛力的常駐NP祖細(xì)胞，并揭示了椎間盤(pán)退變的有希望的診斷和治療靶點(diǎn)。（DOI:10.1002/advs.202104888）

2月24日，烏得勒支大學(xué)、香港中文大學(xué)-四川大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)在《Nat?Commun》（IF=12.121）發(fā)表了題為“人類(lèi)腦室下區(qū)祖細(xì)胞的單細(xì)胞分析將?SFRP1?識(shí)別為重新激活祖細(xì)胞的目標(biāo)”的研究成果。該研究分離出來(lái)自老年人腦室下區(qū)（SVZ）?的祖細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，據(jù)揭示了老年人SVZ?的祖細(xì)胞作為晚期少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的身份，將Wnt通路拮抗劑SFRP1確定為促進(jìn)老年人SVZ祖細(xì)胞靜止的可能信號(hào)。（DOI:10.1038/s41467-022-28626-9）

2月25日，溫州醫(yī)科學(xué)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Acta?Pharmacol?Sin》（IF=6.150）發(fā)表了題為“抗糖尿病藥物canagliflozin阻礙小鼠骨骼肌再生”的研究成果。研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卡格列凈會(huì)損害固有的肌源性再生，并利用單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示了LARS2通過(guò)影響線粒體結(jié)構(gòu)和活性在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化和肌肉再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該研究的單細(xì)胞RNA測(cè)序和分析由百邁客提供。（DOI:10.1038/s41401-022-00878-7）

2月24日，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Genomics》（IF=6.205）發(fā)表了題為“單細(xì)胞測(cè)序揭示了絨山羊毛囊再生中真皮乳頭細(xì)胞的新存在形式”的研究成果。該研究對(duì)具有明顯毛囊周期性的絨山羊進(jìn)行scRNA測(cè)序，構(gòu)建了真皮乳頭細(xì)胞譜系分化軌跡，揭示了參與細(xì)胞命運(yùn)決定的關(guān)鍵基因、信號(hào)和功能和毛囊再生的分子景觀。（DOI:10.1016/j.ygeno.2022.110316）

總?結(jié)

在發(fā)育方面，單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新興技術(shù)正在為理解協(xié)調(diào)細(xì)胞命運(yùn)決定的結(jié)構(gòu)和組織模式的分子調(diào)控提供新的視角。從2月發(fā)表的文章可以看出，更多物種、更多器官的發(fā)育分化正在被解析。

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參考文獻(xiàn)

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