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微生物多樣性測(cè)序分析

精準(zhǔn)解析微生物種屬水平上的組成和豐度

產(chǎn)品介紹

微生物多樣性測(cè)序

微生物多樣性測(cè)序是對(duì)環(huán)境樣品中細(xì)菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA進(jìn)行特定長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種和一些未知物種進(jìn)行檢測(cè)，精準(zhǔn)解析微生物在種屬水平上的組成和豐度情況，是當(dāng)前研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術(shù)手段。

細(xì)菌微生物多樣性

16S?rDNA測(cè)序：16S?rDNA具有10個(gè)保守區(qū)和9個(gè)高變區(qū)。保守區(qū)反映生物物種間的親緣關(guān)系，高變區(qū)反映物種間的差異。對(duì)16S?rDNA某個(gè)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，用于研究環(huán)境微生物中的群落結(jié)構(gòu)多樣性。

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16S rDNA序列及常用擴(kuò)增引物序列
真菌微生物多樣性

18S?rDNA測(cè)序：18S?rDNA也包含可變區(qū)和保守區(qū)。對(duì)18S?rDNA某個(gè)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，用于研究環(huán)境樣本中真核微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

ITS1測(cè)序：ITS分為兩個(gè)區(qū)域：ITS1和ITS2。ITS區(qū)域進(jìn)化速率是18S rDNA的10倍之多。對(duì)ITS1和ITS2進(jìn)行測(cè)序，用于研究環(huán)境樣本中真核微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

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ITS rDNA序列及常用擴(kuò)增引物序列
功能基因多樣性

功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關(guān)注的一類微生物，如硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌等，使這些功能細(xì)菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱為功能基因，如AOA、AOB、nifH等。

功能基因測(cè)序，是根據(jù)復(fù)雜環(huán)境中具有特殊功能的微生物基因序列設(shè)計(jì)引物，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建庫(kù)后進(jìn)行高通量測(cè)序。功能基因測(cè)序可有效研究特定環(huán)境中的功能微生物物種信息，包括：功能微生物功能差異、分類和豐度等，并與每個(gè)采樣點(diǎn)的環(huán)境因子相結(jié)合，可以同時(shí)分析環(huán)境因子與功能細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，因此對(duì)復(fù)雜環(huán)境中的微生物構(gòu)成研究有重要的指導(dǎo)作用。

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技術(shù)路線

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技術(shù)策略與送樣要求

測(cè)序策略

Illumina NovaSeq測(cè)序

?DNA送樣要求

DNA濃度≥1ng/ul，總量≥30ng，DNA電泳條帶清晰，無(wú)降解或者輕度降解。

環(huán)境樣品取樣方法及送樣要求

環(huán)境樣品 送樣要求 保存及運(yùn)輸
普通土壤 除去土壤表層未分解的凋落物層、動(dòng)植物殘?bào)w、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品搗碎，過(guò)2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。 樣本-80℃或液氮中長(zhǎng)期保存，干冰運(yùn)輸
根際土壤 收集植物植株，去除根部大塊土壤；搖動(dòng)植株去除附著不緊密的土壤，使用無(wú)菌刷子收集根部附著緊密的土壤；隨機(jī)多點(diǎn)取樣5-10g，過(guò)2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。
糞便 無(wú)菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內(nèi)部（避免表層中的腸道膜脫落細(xì)胞），外部容易污染且細(xì)菌DNA由于接觸空氣可能有降解。將已取的糞便樣品分裝至2mL?EP管（無(wú)菌）或凍存管（無(wú)菌）中，每管糞便量為0.5~2g，每個(gè)樣品分裝2~3管備份。
腸道內(nèi)容物 在實(shí)驗(yàn)對(duì)象死亡后，無(wú)菌條件下，取出整個(gè)腸道，用無(wú)菌解剖刀切取所需腸段的，用無(wú)菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物分裝至2mL?EP管（無(wú)菌）或凍存管（無(wú)菌）中，每管組織量為0.5~2g，每個(gè)樣品分裝2~3管備份
水體 過(guò)濾大量低微生物含量的清亮水樣用0.22μm?的聚苯醚砜濾膜，每個(gè)樣本至少1L水樣。渾濁水樣使用0.22μm濾膜過(guò)濾緩慢容易堵塞時(shí)，建議使用0.45μm的混合纖維素酯濾膜，每個(gè)樣本0.5L-1L水樣；如果水樣中不可溶解的顆粒較多，需要使用2-5μm孔徑的濾膜將不可溶解的顆粒雜質(zhì)濾去，再使用0.22μm或0.45μm的濾膜富集菌體，每個(gè)樣本0.5L-1L水樣。
空氣 開動(dòng)采樣儀（浮游細(xì)菌采集器），使被測(cè)空氣濾過(guò)凝膠膜（滅菌），空氣中的浮游菌被截留在凝膠膜上（過(guò)濾時(shí)間越長(zhǎng)，收集的空氣中的灰塵越多，菌數(shù)量越多），收集完成后取下濾膜。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)與項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

高水平分析團(tuán)隊(duì)

豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

全面的分析內(nèi)容

專業(yè)的售后服務(wù)

數(shù)據(jù)質(zhì)控

數(shù)據(jù)下機(jī)后根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列Tags，同時(shí)對(duì)Reads的質(zhì)量和Merge的效果進(jìn)行質(zhì)控，主要包括去除低質(zhì)量Tags和去嵌合體

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物種注釋

根據(jù)97%的相似度進(jìn)行OTU聚類后，基于Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，繪制樣品在各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，柱狀圖展示不同樣品中物種的組成和相對(duì)豐度。

Alpha多樣性分析

Alpha多樣性（Alpha diversity）反映的是單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，有多種衡量指標(biāo)：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)簡(jiǎn)單的反映出群落中物種的數(shù)量；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量群落多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度（Community evenness）的影響。Chao1、Ace、Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。另外還統(tǒng)計(jì)了樣本文庫(kù)的覆蓋率 Coverage，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。

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weighted unifrac

Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要采用 binary jaccard、 bray curtis、 weighted unifrac(限細(xì)菌)、 unweighted unifrac (限細(xì)菌)等4種算法計(jì)算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值。這四個(gè)算法主要分為兩大類：加權(quán)（Bray-Curtis和Weighted Unifrac）與非加權(quán)（Jaccard和Unweightde Unifrac）。利用非加權(quán)的計(jì)算方法，主要比較的是物種的有無(wú)；而加權(quán)方法，則需要同時(shí)考慮物種有無(wú)和物種豐度兩個(gè)問(wèn)題。樣品間距離越小，說(shuō)明兩個(gè)群體的物種組成越相似。

LEfSe分析

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析主要用于發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker，根據(jù)設(shè)定的Biomarker篩選標(biāo)準(zhǔn)（LDA score>4）找出符合條件的Biomarker。

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主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）

PCA是一種分析和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過(guò)將方差進(jìn)行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，通過(guò)分析不同樣品 OTU（97%相似性）組成可以反映樣品的差異和距離，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差的兩個(gè)特征值。圖中兩個(gè)樣品距離越近，則表示這兩個(gè)樣品的組成越相似。

16S功能預(yù)測(cè)

16S功能預(yù)測(cè)基于PICRUSt軟件通過(guò)比對(duì)16S測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

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相關(guān)性分析

網(wǎng)絡(luò)圖是相關(guān)性結(jié)果的一種表現(xiàn)形式，根據(jù)各個(gè)物種在各個(gè)樣品中的豐度以及變化情況，使用sparcc算法進(jìn)行相關(guān)分析，圖中線的粗細(xì)代表相關(guān)性的強(qiáng)弱；線的顏色表示相關(guān)性：紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)。

成功案例展示

案例一

Degradation of polyethylene plastic in soil and effects on microbial community composition

發(fā)表時(shí)間：2021

合作單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)

發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials

研究背景：全球土壤系統(tǒng)中的塑料污染正成為一個(gè)嚴(yán)重的全球性問(wèn)題，對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)和人類健康構(gòu)成潛在威脅。為了確定聚乙烯薄膜的降解性和生態(tài)效應(yīng)，本研究以小麥為試材，通過(guò)盆栽試驗(yàn)，研究塑料降解與土壤微生物群落組成之間的相互作用。

測(cè)序策略： 16S V3+V4 Illumina Hiseq 2500 PE250

研究結(jié)論：不同條件下的PE膜具有獨(dú)特的降解性能，改變了土壤微生物群落組成。此外，在塑料薄膜上形成了一個(gè)巨大的獨(dú)特的微生物群，這可能會(huì)改變土壤的基本性質(zhì)。PE膜可能是一種獨(dú)特的微生物定殖基質(zhì)，可能促進(jìn)其自身降解，改變生物地球化學(xué)過(guò)程和土壤生態(tài)功能。

參考文獻(xiàn)： Daofen Huang, Yibo Xu, Fadan Lei, Xiaoqin Yu, Zhuozhi Ouyang, Yanhua Chen, Hanzhong Jia, Xuetao Guo,Degradation of polyethylene plastic in soil and effects on microbial community composition,Journal of Hazardous Materials,2021

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不同條件下微生物群落中共有和特有OTUs的維恩圖
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不同條件下微生物群落結(jié)構(gòu)三元相圖
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不同條件下微生物門水平相對(duì)豐度

案例二

Nitrogen removal mechanism of marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater in response to ultraviolet (UV) irradiation: High UV tolerance and microbial community shift

發(fā)表時(shí)間：2021

合作單位：青島大學(xué)

發(fā)表期刊： Bioresource Technology

研究背景：海洋厭氧氨氧化菌(MAB)可以自然克服鹽脅迫，但其生長(zhǎng)速率低、對(duì)操作條件敏感仍是應(yīng)用厭氧氨氧化的挑戰(zhàn)。為增強(qiáng)MAB的富集，深入了解紫外線輻照與MAB的關(guān)系，將紫外線引入MAB脫氮工藝中，研究MAB在不同紫外線劑量下處理含氮含鹽廢水的脫氮機(jī)理，分析不同紫外線劑量引起的胞外多聚物(EPS)含量、關(guān)鍵酶活性和微生物群落組成及紫外線照射下微生物預(yù)測(cè)功能的動(dòng)態(tài)探討。

測(cè)序策略： 16S V3+V4 Illumina Hiseq 2500 PE250

研究結(jié)論：在處理含氮鹽漬廢水中，念珠菌對(duì)UV-C輻照的耐受性較高，可達(dá)12000 mJ/cm2。在此劑量下，微生物豐富度增加，多樣性降低，MAB的相對(duì)豐度提高了1.2倍。過(guò)量的EPS產(chǎn)量和厭氧氨氧化菌的特殊結(jié)構(gòu)是維持紫外輻射下厭氧氨氧化活性的兩條防線。

參考文獻(xiàn)： Yuanyuan Gao, Jin Li, Huiyu Dong, Zhimin Qiang,Nitrogen removal mechanism of marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater in response to ultraviolet (UV) irradiation: High UV tolerance and microbial community shift,Bioresource Technology,2021

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實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
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門水平微生物群落結(jié)構(gòu)
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KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)微生物功能預(yù)測(cè)分析
Q1.微生物多樣性中OTU是指什么？

OTU（Operational Taxonomic Unit ）即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。在微生物多樣性分析中，根據(jù)不?同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%?（種水平）就可以把它定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU代表一個(gè)物種。

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百邁客云

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Q2.Beta多樣性四種距離算法的差異？

Beta 多樣性分析主要采用 binary jaccard、 bray curtis、 unweighted Unifrac(限細(xì)菌)、weighted Unifrac (限細(xì)菌)等4種算法計(jì)算樣品間的距離，那么這四種算法都有什么差別呢？

非加權(quán)的計(jì)算方法，主要考慮的是物種的有無(wú)，即如果兩個(gè)群體的物種類型都一致，表示兩個(gè)群體的樣本距離最??；加權(quán)方法，則同時(shí)考慮物種有無(wú)和物種豐度兩個(gè)問(wèn)題。比如如樣品A由3個(gè)物種a和2個(gè)物種b組成，樣品B由2個(gè)物種a和3個(gè)物種b組成，則通過(guò)非加權(quán)方法計(jì)算，因?yàn)闃悠?span lang="EN-US">A與樣品B的物種組成完全一致，都只由物種a和b組成，因此它們之間的樣本距離為0。但通過(guò)加權(quán)方法計(jì)算，雖然樣品A與樣品B的物種組成一致，但物種a和b的數(shù)目卻不同，因此兩個(gè)群體的β多樣性則并非一致。

基于獨(dú)立OUT的方法認(rèn)為OTU之間不存在進(jìn)化上的聯(lián)系，每個(gè)OTU間的關(guān)系平等；基于系統(tǒng)發(fā)生樹計(jì)算的方法，會(huì)根據(jù)16s的序列信息對(duì)OTU進(jìn)行進(jìn)化樹分類， 因此不同OTU之間的距離實(shí)際上有“遠(yuǎn)近”之分。

Q3.PCA與PCoA的區(qū)別？

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一種分析和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過(guò)將方差進(jìn)行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上；主坐標(biāo)分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一種與 PCA 類似的降維排序方法。PCoA與PCA的區(qū)別在于PCA是基于原始的物種組成矩陣所做的分析，使用的是歐式距離，僅僅比較的是物種豐度的不同，而PCoA首先根據(jù)不同的距離算法計(jì)算樣品之間的距離，然后對(duì)距離矩陣進(jìn)行處理，使圖中點(diǎn)間的距離正好等于原來(lái)的差異數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)定性數(shù)據(jù)的定量轉(zhuǎn)換。