高通量測序技術的飛速發(fā)展，使得基因數據量直線飆升，隨之而來的就是對基因功能研究的新挑戰(zhàn)。做完測序我們得到感興趣的基因或ncRNA，并對它們的功能、作用機制做生信方面的分析后，如果我們要深入研究下去，就需要依靠分子實驗手段做篩選到的感興趣基因或ncRNA的功能及作用機制方面的研究。
基因或ncRNA研究組成模塊本質上是差不多的，都是由生物學問題、分子（基因或ncRNA）、功能和機制、通路組成，而每個層面又有針對于不同情況的具體的實驗技術，而文章的千變萬化就在于這些模塊之間、這些技術之間的不同組合。

01.表達量檢測、定位、全長鑒定：縮小范圍，找到重點

對于很多研究，第一步一般都會去驗證從測序結果中篩選到的基因或ncRNA，主要驗證要研究的基因或ncRNA的表達量（RT-qPCR、northern、WB）、
表達在組織或亞細胞間的特異性（RT-qPCR、northern、FISH、GFP融合蛋白、核質分離）、序列的準確性及是否有新的可變剪切（5’/3’RACE）等。

這一步可以縮小研究的范圍，有時候也會發(fā)現(xiàn)新的興趣點，比如這篇Journal of Experimental Botany的文章中，作者發(fā)現(xiàn)了slctr4基因的一個新的可變剪切命名為slctr4vs3，并且在slctr4的3個可變剪切中只有slctr4sv3與sly-mir-1917呈負相關
（負相關是miRNA調控靶基因最常見的方式，說明這個miRNA很可能調控這個基因），在后期的Y2H實驗和BiFC實驗中發(fā)現(xiàn)slctr4sv3與SlEIN2互作，這樣就打通了miRNA-1917-slctr4-SlEIN2這樣一條通路。

02.基因功能研究

做完這部分基礎的驗證后，就需要驗證基因或ncRNA的功能，功能的驗證主要分兩類：獲得性研究和缺失性研究，獲得性研究即通過VIGS或遺傳轉化/轉基因讓目的基因過表達，缺失性研究即用RNAi、CRISPR/Cas9等技術讓目的基因沉默或突變?yōu)闊o功能基因。通過這部分研究可以驗證目的基因的功能。

比如這篇發(fā)表在Developmental Cell的章中對lncRNA COLDWRAP的RNAi敲除品系表現(xiàn)出減少的春化反應，將COLDWRAP轉入COLDWRAP突變體后，COLDWRAP表達恢復了春化反應。

03.作用機制研究：文章容易出彩的地方

目的基因或ncRNA研究完，進一步就需要探討目的基因是如何發(fā)揮作用的，比如上述lncRNA COLDWRAP，是通過什么方式對春化作用產生影響的呢？這就需要研究COLDWRAP的作用機制，很多高分文章都是這部分的研究非常精彩！
比如，下面這篇發(fā)表在Plant Cell上的文章，作用機制部分研究就比較精彩。
作者先在體外，用酵母雙雜交鑒定FRI蛋白互作的蛋白，發(fā)現(xiàn)FRI的N端區(qū)域與其與LRB1和LRB2的相互作用是重要的，F(xiàn)RI的C端區(qū)域和CUL3A的N端區(qū)域是它們相互作用所必需的。之后用GST pull-down驗證酵母雙雜交結果。

之后在體內，用BiFC在體內驗證定位、酵母雙雜交、GST pull-down結果，用co-IP分析瞬時表達FRI和CUL3A再次驗證相互作用。

最后通過體外降解試驗發(fā)現(xiàn)FRI通過泛素-26蛋白酶體途徑降解，表明CUL3A和LRB1 / 2是FRI降解所必需的，F(xiàn)RI降解是CUL3A，LRB1 / 2和蛋白酶體依賴性過程介導。最終得出蛋白酶體介導的FRI降解調節(jié)擬南芥春化過程中開花的結論。

?04.把生物學故事串起來

好的研究最終能依靠轉錄因子、信號通路等把研究結果串起來，系統(tǒng)地解釋一個生物學問題。

比如上面談到的Plant Cell的文章，作者發(fā)現(xiàn)轉錄因子WRKY34的轉錄迅速被冷應激誘導，之后構建pCUL3A-LUC載體和W-box區(qū)域突變pCUL3A-LUC載體，與WRKY34共注射入煙草和擬南芥葉原生質體，來驗證WRKY34以預測的W-box與CUL3A啟動子結合以增加其CUL3A轉錄，而CUL3A又介導FRI降解調節(jié)擬南芥春化過程中的開花，從而把生物學故事由冷誘導—WRKY34轉錄—CUL3A轉錄—FRI降解—擬南芥春化過程中的開花這樣一條線串起來。

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