外顯子是基因組中能夠轉錄組出成熟RNA的部分，外顯子組(exome)是基因組中所有外顯子的集合。人類擁有約18萬個外顯子，約占人類基因組的1%，即約3000萬個bp(30MB)。全外顯子組測序是指通過探針捕獲基因組中外顯子區(qū)域的DNA序列，并進行集中測序分析，從而找到致病變異或鎖定與疾病相關的基因，對于遺傳性疾病及腫瘤等病變病理成因確認以及治療靶點鎖定有重要作用。

沈陽醫(yī)學院高兵教授團隊在?Redox Biology?雜志發(fā)表題為“ Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation ”?的研究論文，結合全外顯子測序與轉錄組等組學數(shù)據(jù)分析，解釋ATP1A1在腎晶體形成中起到的重要作用，表明ATP1A1可能是治療鈣結石的潛在治療靶點。ong>

英文標題：Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation

中文標題：腎結石病的Meta數(shù)據(jù)分析揭示ATP1A1參與腎晶體形成

發(fā)表期刊：Redox Biology

合作單位：沈陽醫(yī)學院

影響因子：10.7

研究對象：CaOx腎結石患者及對照組樣本

研究方法：全外顯子測序（WES）+表達譜數(shù)據(jù)分析

百邁客生物為該研究提供了外顯子測序服務。

研究背景

腎結石在全球范圍內(nèi)都威脅著人類的生命健康，近年來發(fā)病率和復發(fā)率都不斷上升，大多數(shù)腎結石由草酸鈣（Calcium ox）結石組成，晶體-細胞粘附被認為是晶體保留和結石形成中的關鍵步驟，有研究報道，受損的腎小管上皮細胞對晶體附著的親和力增加，而晶體沉積通過產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）反過來又誘導細胞損傷和炎癥反應。Na/K-ATPase（NKA）是一種在腎臟中高度表達的跨膜離子泵，同時其由ATP1A1編碼的α1亞基也起到信號轉導器的作用，當?ATP1A1?構象改變或被敲低時，Src 就會被磷酸化并激活下游信號級聯(lián)，進而導致 ROS 的產(chǎn)生，ROS可以激活MAPK級聯(lián)反應和NF-κB炎癥反應，并作為ATP1A1的配體啟動ATP1A1/Src信號通路，從而形成NKA/ROS擴增環(huán)，誘導氧化應激，然而，ATP1A1在腎結石形成中的作用尚不清楚。本實驗結合多組學分析方法，以期提供一種有用的方法，研究腎結石形成病理。

材料方法

實驗材料：28例中國漢族CaOx腎結石患者及對照組樣本

組學方法：全外顯子測序（WES）+表達譜數(shù)據(jù)分析

研究結果

首先該研究從GEO數(shù)據(jù)中獲取了腎臟鈣結石患者的表達譜數(shù)據(jù)化，其中患者的RP組織（Randall斑塊）命名為P組，患者的正常組織命名為N組，對其表達譜篩選基因進行WGCNA分析，選擇與樣本相關性較高的淺橙色模塊（434個基因）進行后續(xù)研究，GO富集結果表明這些基因在質膜和跨膜轉運中富集。KEGG富集分析顯示，這些基因參與“醛固酮調節(jié)的鈉重吸收”、“礦物質吸收”、“內(nèi)分泌等因子調節(jié)的鈣重吸收”和“近端小管碳酸氫鹽回收”等通路，進一步查看發(fā)現(xiàn)，FXYD2、FXYD4、ATP1A4、ATP1A1和ATP1B1等5個編碼NKA的基因參與了跨膜轉運、吸收和重吸收的過程，表明NKA可能與腎結石密切相關。

為進一步探究腎結石相關關鍵基因，該研究對28例中國漢族CaOx結石患者進行了WES分析，共鑒定得到76個SNPs，其中錯義SNPs31個，編碼同義SNPs30個，3′UTR7個SNPs，5′UTR區(qū)8個SNPs，作為候選SNPs，這些突變位點定位于67個基因，將這67個基因與WGCNA分析中的434個基因做韋恩圖取交集，發(fā)現(xiàn)ATP1A1是兩個數(shù)據(jù)集交叉點中的唯一基因，一定程度上說明了ATP1A1在鈣結石形成中的潛在作用。

接下來，該研究從WES數(shù)據(jù)中提取了ATP1A1的SNP，rs11540947 T等位基因在患者組中的突變頻率頻率為16.1%，而對照組僅為2.4%。為進一步證實rs11540947與鈣結石形成的相關性，收集214例鈣結石患者和232例匹配對照，通過HRM分析檢測rs11540947的基因型，結果顯示，CT+TT攜帶者在患者中比對照組更常見，且在男性中與鈣結石有關，但在女性中無顯著相關性，SNPrs11540947 （NM_000701:c.-78C > T）位于?ATP1A1?的 5′UTR 中；在ATP1A1的5′UTR中發(fā)現(xiàn)了Sp1結合位點和潛在的TATA盒，表明5′UTR具有啟動子活性，雙熒光素酶報告基因結果也證明了這一點，rs11540947的T等位基因介導了ATP1A1啟動子活性的顯著降低，這可能會降低ATP1A1在轉錄水平的表達。對草酸鈣一水合物（COM）暴露處理的HK2細胞（人腎近曲小管上皮細胞）進行指標測定，結果顯示處理3h后，NKA酶活性和ATP1A1 mRNA水平顯著下降，6h后ATP1A1的蛋白水平升高，隨后降低，同時COM 暴露后細胞內(nèi) ROS 水平顯著增加，這可能與ATP1A1/Src信號通路的激活有關，而ATP1A1的過表達抑制了COM誘導的Src、p38、JNK、p65和p50激活；WB結果也顯示COM激活的半胱天冬酶3被ATP1A1的過表達以及ATP1A1/Src信號復合物的特異性拮抗劑pNaKtide顯著抑制，從而阻斷了細胞凋亡過程。

晶體與細胞的粘附是結石形成的關鍵過程，晶體沉積會損傷腎細胞，因此，作者研究了ATP1A1在晶體-細胞粘附中的作用。該研究觀察到用 Ad-hATP1A1 感染和用 pNaKtide 處理后，Ca²⁺濃度與對照組相比顯著降低，表明ATP1A1過表達和pNaKtide可以阻止晶體與細胞的粘附，從而保護細胞免受CaOx晶體誘導的損傷并減少腎結石的形成。DNA啟動子中CpG島的甲基化是基因沉默的常見機制，COM暴露后，DNA甲基轉移酶（DNMTs）的mRNA和蛋白質水平均顯著升高，而用DNA甲基化抑制劑5Aza-2dc預處理HK2細胞再進行COM暴露處理后，ATP1A1表達量下調；ATP1A1的蛋白水平也被逆轉。這些結果表明，改變的DNA甲基化參與了COM誘導的ATP1A1降低。

為了證實ATP1A1對體內(nèi)晶體形成的影響，該研究構建了CaOx腎病大鼠模型，用 pNaKtide 治療后尿草酸鹽排泄量顯著減少，與體外研究結果類似，HYP+CaCl2處理降低了 ATP1A1 mRNA和蛋白質表達水平，激活了 Src、p38、JNK、p65 和 p50，降低 Nrf2 表達，而這些均被pNaKtide逆轉，這些結果強調了ATP1A1和ATP1A1/Src信號通路在腎結石形成中的重要性。

 

研究總結

綜上所述，該研究從遺傳水平和環(huán)境因子影響的轉錄水平探究腎結石相關關鍵易感基因，將鈣結石形成者Randall斑塊（RP）組織的基因表達譜數(shù)據(jù)與CaOx患者的WES數(shù)據(jù)相結合，鑒定出ATP1A1這一關鍵基因，還研究了ATP1A1遺傳變異與鈣結石風險的關聯(lián)，并進一步探討了ATP1A1/Src/ROS信號在體外和體內(nèi)腎結石形成中的作用，這項研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ATP1A1基因變異及其表達降低參與腎晶體形成的機制，可能為CaOx結石提供潛在的治療靶點。

參考文獻：

Li Y, Lu X, Yu Z, Wang H, Gao B. Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation.?Redox Biol. 2023 May;61:102648. doi: 10.1016/j.redox.2023.102648. Epub 2023 Feb 27. PMID:36871182.