一萬年太久，只爭朝夕，就讓一個億隨風(fēng)去吧，新的一年我們不僅餃子要吃飽，文章也要發(fā)表，蛋白組文章來一波~

1.蛋白組研究簡介
蛋白質(zhì)是生理活動的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機(jī)制。對細(xì)胞或組織的全蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)分析的蛋白質(zhì)組學(xué)，是目前發(fā)展迅速的組學(xué)研究之一，已被廣泛用于生長發(fā)育、抗逆性狀改良、免疫互作、藥物作用機(jī)制、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等的研究。
所謂“工欲善其事，必先利其器”，科學(xué)研究也一樣，下面就給大家介紹一下已被廣泛應(yīng)用到蛋白組研究中的iTRAQ技術(shù)。

2.iTRAQ技術(shù)介紹
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。

圖1 iTRAQ技術(shù)簡介

iTRAQ試劑由三部分組成：報告基團(tuán)；質(zhì)量平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)標(biāo)記試劑基團(tuán)，可形成4種或8種相對分子質(zhì)量均為145的等量異位標(biāo)簽。

圖2 iTRAQ試劑標(biāo)記肽段

iTRAQ試劑標(biāo)記酶解后的肽段，可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同重元素(isobaric)。在一級質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，報告基團(tuán)斷裂下來產(chǎn)生報告離子，根據(jù)報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。

3.iTRAQ文獻(xiàn)
據(jù)不完全統(tǒng)計，通過iTRAQ技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)研究，發(fā)表的文章已達(dá)到2500+，通過iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白組研究發(fā)表文章，接收率還是非常高的~下面iTRAQ文章簡介來一波~

01 抗逆性狀改良
植物在遇到各種環(huán)境侵害(如高溫、低溫、干旱、高鹽、高滲透壓、臭氧及機(jī)械損傷等)時會發(fā)生應(yīng)激保護(hù)措施。這些脅迫可以引起大量的蛋白質(zhì)在種類和表達(dá)量上的變化,通過對耐旱能力不同的小麥品系進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以了解小麥對脅迫的適應(yīng)機(jī)制。

實驗設(shè)計：
小麥抗旱品種Opata，小麥耐旱品種Nesser，兩個品種。
取正常培養(yǎng)及ABA處理條件后的根，共4組。
測序策略：
iTRAQ（三個生物學(xué)重復(fù)，采用三個iTRAQ4標(biāo)）、LC-MS/MS、qRT-PCR。
研究結(jié)果：
1、利用iTRAQ方法共鑒定出1656個蛋白，其中936個為顯著差異蛋白。
2、從差異分析結(jié)果中，篩選出抗旱能力不同的小麥中特有蛋白（同時對ABA處理有響應(yīng)）；通過qRT-PCR的方法進(jìn)行驗證。
文章亮點：
除了對相同作物不同品系與處理條件進(jìn)行的蛋白組比較研究，本研究的小麥蛋白組數(shù)據(jù)庫采用多個不同的小麥數(shù)據(jù)庫，極大提升了蛋白鑒定數(shù)量。

02 動物生長發(fā)育
豬肉的生長速率和肉質(zhì)是其重要的兩個經(jīng)濟(jì)學(xué)指標(biāo)，由多種基因和生物學(xué)通路調(diào)控，通過蛋白組學(xué)研究可以充分了解動物生長發(fā)育相關(guān)蛋白，為品質(zhì)改良打下基礎(chǔ)。

實驗設(shè)計：
中國本土品種：藏豬（TP）、滇南小耳豬（DSP）。
西方引進(jìn)品種：約克豬（YY）和長白豬（LL）的背最長肌樣本。六月齡取樣，以尋找參與豬肌肉生長和脂肪沉積的關(guān)鍵蛋白。
測序策略：
iTRAQ（兩個生物學(xué)重復(fù)，采用一個iTRAQ8標(biāo)）、LC-MS/MS、PRM分析技術(shù)。
研究結(jié)果：
作者應(yīng)用iTRAQ對四組樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出了4815個多肽，對應(yīng)969種蛋白。在這之中有288種為差異性表達(dá)蛋白（DEPs），其中169種蛋白在TP-DSP組上調(diào)，119種下調(diào)。
作者隨即對這些DEPs分別進(jìn)行了GO和KEGG分析，篩選出了28種與肌肉生長相關(guān)和15種與脂肪沉積相關(guān)的蛋白。
文章亮點：
本文最后應(yīng)用PRM對iTRAQ的分析結(jié)果進(jìn)行驗證，由于此方法需要目標(biāo)蛋白有樣本中唯一的多肽作為標(biāo)記，因此只對其中的12種蛋白進(jìn)行了PRM分析，結(jié)果均與iTRAQ一致，提高了實驗結(jié)果的可信度。

03 免疫互作
玉米作為世界范圍內(nèi)主要作物,受昆蟲攻擊造成巨大的生產(chǎn)損失。文章旨在研究玉米受食草昆蟲攻擊的響應(yīng)機(jī)制，著重分析與機(jī)械損傷相比，食草昆蟲的口腔分泌物對植物-昆蟲之間互作所起的作用。

實驗設(shè)計：
W組：未處理的玉米葉片；W+W組：20 μL水處理V3期玉米機(jī)械損傷的葉片；
W+OS 組：20μL口腔分泌液處理V3期玉米機(jī)械損傷的葉片。
測序策略：
轉(zhuǎn)錄組測序（三個生物學(xué)重復(fù)）：W+W組和W+OS 組，處理1.5h、6h。
iTRAQ蛋白定量技術(shù)（三個生物學(xué)重復(fù)）。
靶向代謝組：激素表達(dá)水平檢測，篩選測序時間點；非靶向代謝組。
研究結(jié)果：
4406個差異表達(dá)的基因中，4142個基因沒有檢測到相應(yīng)的蛋白表達(dá)，只有64個基因在蛋白水平上有明顯變化。差異表達(dá)的蛋白有294個，其中214個在轉(zhuǎn)錄水平上沒有顯著差異，推測這些蛋白很可能存在轉(zhuǎn)錄后修飾。
文章亮點：
文章利用多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)）技術(shù)聯(lián)合分析玉米受植食昆蟲攻擊后的響應(yīng)機(jī)制，并構(gòu)建繪制了系統(tǒng)的調(diào)控模型。這些數(shù)據(jù)對玉米防御昆蟲災(zāi)害的進(jìn)一步遺傳學(xué)研究搭建了很好的框架，也為抗昆蟲災(zāi)害的玉米新品種的培育奠定了良好的基礎(chǔ)。

4.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白庫

廣大人民群眾喜聞樂見的餃子餡料，比如韭菜、茴香和大白菜等，至今還基本沒有進(jìn)行蛋白組研究。作為百合科植物，韭菜的基因組較大，至今都沒有其基因組信息發(fā)表出來，公共數(shù)據(jù)庫中的信息也很少，所以關(guān)于韭菜的基因檢測研究一直都是個空白。
類似韭菜這種研究結(jié)果比較少的物種，可以采用轉(zhuǎn)錄組+蛋白組的測序方式，用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白組數(shù)據(jù)庫，后期進(jìn)行蛋白的定性及定量，對蛋白鑒定數(shù)量的提升也有很大助力。

參考文獻(xiàn)
[1]Wang Z, Peng S, Li Q, et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs[J]. Sci Rep, 2017, 7:46717.
[2]Alvarez S, Choudhury S R, Pandey S. Comparative Quantitative Proteomics Analysis of the ABA Response of Roots of Drought-Sensitive and Drought-Tolerant Wheat Varieties Identifies Proteomic Signatures of Drought Adaptability[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(3):1688-701.
[3]Qi J, Sun G, Wang L, et al. Oral secretions from Mythimna separata insects specifically induce defense responses in maize as revealed by high-dimensional biological data[J]. Plant, 2016, 39(8):1749.

轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部 小 張丨文案
吳戈宇 | 審核
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