回顧2018，百邁客轉(zhuǎn)錄調(diào)控項(xiàng)目文章收獲頗豐：據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已突破百篇，累積影響因子300+，涉及轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、降解組和原核轉(zhuǎn)錄組等。本次項(xiàng)目文章分享中，我們一起走進(jìn)微小生物世界，去看一看里面的大乾坤~
中文題目：在鹽刺激下對(duì)耐鹽擬諾卡氏菌YIM 90087T進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和四氫嘧啶分析
英文題目：Transcriptomic and Ectoine Analysis of HalotolerantNocardiopsis gilva?YIM 90087T?Under Salt Stress
發(fā)表雜志：Frontiers in Microbiology
影響因子：4.019
發(fā)表時(shí)間：2018.03
研究背景
材料方法
試驗(yàn)內(nèi)容：
1、使用不同鹽濃度（0~15%）處理，觀察N.gilva?YIM 90087T的形態(tài)學(xué)變化、增殖、四氫嘧啶及羥基四氫嘧啶檢測(cè)，進(jìn)行表型測(cè)定
2、提取中期對(duì)數(shù)期YIM 90087T菌體RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
測(cè)序平臺(tái)：北京百邁客生物科技有限公司?Illumina Hiseq
研究結(jié)果
1、鹽含量對(duì)N. gilva?YIM 90087T的形態(tài)學(xué)和增殖情況影響
隨著鹽濃度的增高，菌落顏色由黃色變?yōu)榘咨以?%的NaCl鹽溶液中生長(zhǎng)最佳，鹽濃度高于或低于該濃度，其生長(zhǎng)速度均會(huì)下降。
圖1、菌體表型觀察及生長(zhǎng)曲線
2、差異表達(dá)分析
對(duì)菌種進(jìn)行二代測(cè)序，篩選FDR<0.01，F(xiàn)old Change≥2的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因，并使用COG、GO、KEGG、Swissport和NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析。通過(guò)COG分類，共獲得25個(gè)COG組別，其中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝是其主要組分。DEGs被分布在34個(gè)GO term里，其中包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程三大類。與此同時(shí)，三個(gè)比較組（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）差異表達(dá)基因分別富集到77、32和90條KEGG通路中，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝在鹽刺激下扮演相當(dāng)重要的角色。尤其在最大耐受度的NaCl鹽環(huán)境里，參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體通路的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶基因、甜菜堿基因和四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因表達(dá)量都顯著提高。
圖2、三個(gè)比較組的（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）COG注釋
3、N. gilva?YIM 90087T菌種ect基因集的遺傳組成
對(duì)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因ectABCD進(jìn)行種屬分析。其中在18個(gè)擬諾卡氏菌系中存在2個(gè)常見(jiàn)的ectABCD基因簇類型。ectABC屬于一個(gè)基因簇，而ectD則位于基因組的其他位置（type A, 15 strains），又或者ectABCD歸屬于相同的基因簇（type B, 3 strains）。此外，在N. potens?DSM 45234和N.prasina?DSM 43845菌系中發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)ectAB或ectD基因。然而，在N.gilva?YIM 90087T中，基因簇類型卻與其他菌系顯著不同。ectA基因完全與ectBCD基因簇分開(kāi)，且ehuABCD（四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體基因）位于ectD基因的下游。
圖3、四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因基因簇
4、參與四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)情況
對(duì)不同鹽環(huán)境下的參與四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的升高，參與四氫嘧啶合成的基因有不同程度的上調(diào)，尤其在15%的鹽濃度中最顯著。與其他基因不同的是，ectD基因從5%到10%和10%到15%鹽濃度下出現(xiàn)兩次上調(diào)。在N. gilva?YIM 90087T中發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)特殊的ABC受體基因（ehuABCD和?proXWV）參與四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)，并隨著鹽濃度的升高而發(fā)生變化。ehuABCD表達(dá)情況與鹽濃度在大于5%以上時(shí)成正相關(guān)，而proXWV的表達(dá)量變化在耐受鹽濃度環(huán)境中無(wú)變化。有趣的是，ehuABCD和proXWV基因在最大耐受鹽濃度中表達(dá)活性最高。
表1、在不同鹽濃度刺激下四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成與轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)情況
5、N. gilva?YIM 90087T中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的累積
使用HPLC對(duì)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)這兩種物質(zhì)的含量變化會(huì)隨著時(shí)間累積，且積累程度隨著NaCl濃度的升高而增加。值得注意的是，羥基四氫嘧啶在0或5% NaCl濃度下很難被合成；而48h后，在10%和15%的NaCl培養(yǎng)基中被檢測(cè)到。此外，這兩種物質(zhì)含量均會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增加。96h后，在15%的NaCl濃度培養(yǎng)下，四氫嘧啶（33.14 mg/g CDW）和羥基四氫嘧啶（1.17 mg/g CDW）達(dá)到最高水平。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的含量要比羥基四氫嘧啶的含量分別高42.6和28.3倍。這些結(jié)果表明，四氫嘧啶會(huì)在N. gilvaYIM 90087T的胞內(nèi)累積。
除此之外，對(duì)胞外的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶含量進(jìn)行檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)大量的四氫嘧啶被釋放到細(xì)胞外。96h后，在0、10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，分別釋放了89.20%、92.46%、91.99%和71.09%的四氫嘧啶。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，有99.31%和99.08%的羥基四氫嘧啶被釋放到胞外。在15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著增強(qiáng)，而羥基四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)能力則隨著濃度的增加未出現(xiàn)顯著變化。此外，研究表明，將四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為羥基四氫嘧啶的能力會(huì)隨著鹽濃度的增加而增強(qiáng)，在15%的鹽濃度環(huán)境下，有50%的四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為羥基四氫嘧啶，并在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的胞外含量最高。
圖4、N. gilva?YIM 90087T菌種中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)
6、外源四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶對(duì)N.gilva?YIM 90087T生長(zhǎng)的影響
在鹽刺激下，添加外源的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶會(huì)促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)速度。在最適宜的鹽濃度環(huán)境下，添加四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶會(huì)輕微促進(jìn)OD600值，而在高濃度鹽環(huán)境下，外源物會(huì)顯著促進(jìn)OD600值。其中添加外源羥基四氫嘧啶對(duì)菌種的生長(zhǎng)速度促進(jìn)作用優(yōu)于外源四氫嘧啶。
7、大腸桿菌中四氫嘧啶累積
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)在15%的NaCl緩沖液中，四氫嘧啶很難產(chǎn)生，并在0%的緩沖液中檢測(cè)到少量四氫嘧啶。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的合成速率分別在24h和48h中顯著下降，其最大合成速率為[0.5 mg (g CDW)?1?h?1]，而最終產(chǎn)出[28.85 mg (g CDW)?1]?。
總結(jié)
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