說起基因組印記（Genomic imprinting），小編的記憶還停留在上學幫師兄查印記基因（imprinted genes）數(shù)據庫的時候。那個時候其實根本不懂印記到底是什么，只記住了師兄在耳邊的碎碎念“父本印記則母本表達父本甲基化，母本印記則父本表達母本甲基化”。雖然后來做印記方面的工作少了，但是提起基因組印記還是倍感親切（也可能是對當年徹夜的查數(shù)據庫的耿耿于懷）。

今年2月份發(fā)表在核酸研究上的一篇工作就采用了10X左右的Nanopore測序的數(shù)據進行基因印記的相關研究。作者采用兩種方法（Basecall method基于Fastq數(shù)據，Signal method基于原始電信號）對Nanopore測序的read進行單倍型分配，并識別父母本等位差異的甲基化區(qū)域。這些等位差異的甲基化區(qū)域中有部分是已知的印記控制區(qū)，同時結果與RNA-seq等位特異表達和RRBS數(shù)據結果吻合。因此作者認為那些新的等位差異甲基化區(qū)域可能是新的印記控制區(qū)。

關鍵結論

1. Nanopore測序得到的樣品的甲基化水平與RRBS結果一致性很高

2. Nanopore read比RRBS數(shù)據更容易進行單倍型分配，且85.7%的read能夠被正確分配

3. 不同單倍型間識別到的差異甲基化區(qū)域可能是候選的印記控制區(qū)

其實小編還想碎碎念一句，其實Nanopore數(shù)據不是只能做CpG，還能做5mC，6mA啦！分析完甲基化還能再分析分析結構變異呀~ 這么一套牛哄哄的數(shù)據只用來分析CpG還是太可惜啦！

當當當，詳細解讀來啦～～

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研究背景

基因印記作為一個經典的表觀遺傳現(xiàn)象，是指基因的表達具有親本選擇的現(xiàn)象，即只一個親本的等位基因表達，另一個親本的等位基因不表達或很少表達。印記基因在生長發(fā)育中。眾多假設認為DNA甲基化是基因組印記的主要機制，即許多的基因印記是由不同親本來源的等位基因調控區(qū)的差異甲基化造成的。

研究方法

• RRBS：?B6 X Cast
• RNA-seq：4個B6 X Cast正反交子代，4個Cast X B6正反交子代
• Nanopore：B6 X Cast, Cast X B6

研究結果

• ?Nanopore甲基化結果與其他技術結果一致

對B6 X Cast雜交的F1子代的雄性胚胎（E14.5）采用MinION平臺進行8X深度的測序，采用Nanopolish軟件識別甲基化。轉錄起始位點處甲基化水平降低，且如先前報道一致，胎盤組織的全基因組甲基化水平在50%左右。采用RRBS對相同樣品進行測序發(fā)現(xiàn)了兩個技術平臺的甲基化水平相似。

• Nanopore測序的read單倍型有效率更高

作者定義了兩種分配單倍型的方法(Basecall method基于Fastq數(shù)據，Signal method基于原始電信號）。作者將測序數(shù)據與SNP標記的基因組進行比對，如果read上有至少5個高置信的SNP則將單倍型分配給Nanopore read，對于RRBS數(shù)據，只要有一個SNP即分配單倍型。結果發(fā)現(xiàn)只有24%的RRBS測序read被分配了單倍型，而74%的Nanopore測序的read可以被分配單倍型，且父母本等位各一半。同時對于雄性樣品，比對到X染色體上絕大多數(shù)91%的read都被分配為母本單倍型。

為了進一步評估nanopore測序read分配單倍型的準確性，作者又測了B6自交和Cast自交的組織。用相同的單倍型分配步驟，85.7%的read可以正確分配到相關的基因型，而只有1.5%是錯配的。

• 親本特異和品系特異的基因表達

對B6和Cast正反交和自交的F1的胎盤組織分別進行RNA-seq測序。結果發(fā)現(xiàn)135個基因具有親本特異表達，其中88個是母本等位高表達47個是父本等位高表達。而這135個基因中，有53個是已知的印記基因，這其中又有17個（包含F(xiàn)kbp6, Smoc1/2, Gzmc/d/e/f/g, Zdhhc14 and Arid1b）在近期的研究中被認為是印記的。剩下的65個基因則組成了小鼠胎盤中候選的親本偏好表達基因。

• Nanopore測序觀測到的已知的印記控制區(qū)

作者結合nanopore read的單倍型和甲基化數(shù)據來比較親本等位間的甲基化。發(fā)現(xiàn)Nanopore測序的數(shù)據非常容易觀測出已知的印記控制區(qū)的DMR，且與RNA-seq和RRBS的等位特異情況一致。作者發(fā)現(xiàn)Nanopore的數(shù)據涵蓋了大多數(shù)已知的印記控制區(qū)的差異甲基化，而這種甲基化差異往往會延伸到印記控制區(qū)外。

作者接下來嘗試去發(fā)現(xiàn)親本等位間的差異甲基化區(qū)域（DMR）以及品系特異的DMR。作者共得到933個DMR，其中309個可以被親本的差異所解釋，其余則是源自品系的差異。結合RRBS單倍型和RNA-seq的數(shù)據進一步證明了差異甲基化和差異表達，進而找到印記基因上感興趣的DMRs。排名靠前的前20個DMRs中有15個對應于已知的印記控制區(qū)。雖然很多排名靠后的DMR可能是假陽性的，但是這些DMR依然包含了已知區(qū)域的印記表達。

• 差異甲基化分析上長read的優(yōu)勢

最后，作者通過幾個例子闡述了相比于傳統(tǒng)的重亞硫酸鹽測序，基于nanopore的方法在識別親本等位DMR上的諸多優(yōu)勢。這里，小編就不贅述啦。

 

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