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發(fā)布于 2019年4月9日

2018年可謂是蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展歷程上非常重要的一年，以北京蛋白質(zhì)組研究中心秦鈞教授課題組關(guān)于胃癌在蛋白質(zhì)層面進(jìn)行分子分型研究為代表，這篇文章主要就是利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)（label-free）方法對(duì)疾病進(jìn)行分型分析，最終將彌漫性胃癌在蛋白水平分成了3種不同類型，這3種不同的分子亞型對(duì)預(yù)后和化療方案的敏感性是有差別的。

Fig.1?彌漫性胃癌腫瘤組織蛋白質(zhì)組分型

我們看到，盡管都是胃癌，不同亞型的胃癌其實(shí)在蛋白的層面是不同的疾病，因此就會(huì)有不同的預(yù)后，除了癌癥等領(lǐng)域的分子分型和標(biāo)志物篩選驗(yàn)證以外，定量蛋白質(zhì)組學(xué)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫、動(dòng)物發(fā)育、感染性疾病等研究中也有廣泛的應(yīng)用。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Quantitative Proteomics）是對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜混合體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行√確鑒定和定量?？捎糜诤Y選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達(dá)蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)揭示細(xì)胞生理病理等功能，同時(shí)也可對(duì)某些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定性和定量分析。

目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用比較廣泛的方法有非標(biāo)定量（Label-free）和標(biāo)記定量（iTRAQ）兩種。在這里我們給大家介紹一下這兩種定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法：

1、iTRAQ技術(shù)

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽，通過(guò)特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。

技術(shù)原理：iTRAQ標(biāo)記試劑由三部分組成，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)部分，（1）報(bào)告基團(tuán)：有八種，相對(duì)分子質(zhì)量分別為113、114、115、116、117、118、119和121，因此iTRAQ可同時(shí)標(biāo)記8組樣品；（2）平衡部分：相對(duì)分子質(zhì)量分別為32、31、30、29、28、27、26和24，形成相對(duì)分子質(zhì)量均為145的等量異位標(biāo)簽，保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同；（3）肽反應(yīng)部分：能與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接而標(biāo)記上肽段，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)。?

?Fig.2?iTRAQ試劑結(jié)構(gòu)

?Fig.3 iTRAQ實(shí)驗(yàn)二級(jí)質(zhì)譜圖

在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，帶不同同位素標(biāo)簽的同一多肽產(chǎn)生質(zhì)量為114，115，116和117Da（八標(biāo)為113、114、115、116、117、118、119和121 Da）的報(bào)告離子（Fig.3中紅色標(biāo)記），根據(jù)報(bào)告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過(guò)軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。

iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程：

??Fig.4?iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程示意圖

由于iTRAQ技術(shù)上的限制，至多同時(shí)標(biāo)記8個(gè)樣品，所以，當(dāng)樣品數(shù)超過(guò)8個(gè)的時(shí)候就需要設(shè)置內(nèi)參，以矯正不同批次之間的批次差異（搭橋技術(shù)）。比如：做14個(gè)樣品（來(lái)源于同一組織），則需要做成兩組8標(biāo)的進(jìn)行上機(jī)，每組7個(gè)樣品加1個(gè)內(nèi)參（內(nèi)參是多個(gè)樣品的混樣），總共需要做的樣品數(shù)就是7+7+1+1=16個(gè)。

TMT也是近年來(lái)應(yīng)用比較廣泛的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，與iTRAQ一樣，TMT也是采用體外同位素標(biāo)記的方法，利用同位素試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽，對(duì)兩個(gè)或多個(gè)樣本在全蛋白質(zhì)組層面上展開(kāi)相對(duì)定量分析。二者區(qū)別只是不同廠家生產(chǎn)的標(biāo)記試劑盒（iTRAQ是AB SCIEX研發(fā)，至多有8種標(biāo)記試劑，TMT是Thermo Fisher研發(fā)，至多有10種標(biāo)記試劑），在標(biāo)簽分子結(jié)構(gòu)上有些許差異，其他原理基本一樣。

iTRAQ技術(shù)特點(diǎn)：

（1）不同樣本標(biāo)記之后混樣，統(tǒng)一處理上機(jī)，減少了分別上機(jī)造成的實(shí)驗(yàn)誤差，并利用同位素標(biāo)簽的豐度來(lái)檢測(cè)，定量更z確，重復(fù)性更好；

（2）由于需要標(biāo)記試劑標(biāo)記，因此成本相對(duì)較高；

（3）通量高，在一次實(shí)驗(yàn)中至多可同時(shí)比較8個(gè)樣品；

（4）利用基于同一個(gè)參考樣品的辦法，可以進(jìn)行多于8個(gè)樣品的定量比較；

（5）iTRAQ的覆蓋度高、靈敏度高。

2、Label-free技術(shù)

Label-free定量，即非標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，不需要對(duì)比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。