隨著對腫瘤細胞的糖代謝重編程的認識，有氧糖酵解對腫瘤治療的抑制作用越來越受到重視。糖酵解通路中的許多關鍵蛋白已被發(fā)現(xiàn)是治療和克服耐藥性的重要靶點。有氧糖酵解抑制作用的研究主要集中在實體腫瘤來源的細胞模型中，而白血病細胞模型中信息較少，尤其是白血病多藥耐藥（MDR）細胞。因此，有必要從腫瘤代謝的角度研究MDR的分子機制，探討白血病MDR細胞中有氧糖酵解對糖代謝和藥物敏感性的影響。

12月新鮮出爐的公司合作文章中，蘭州大學基礎醫(yī)學院甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室的研究者借助轉錄組測序技術，探究了白血病MDR細胞的代謝重編程機制，對于發(fā)現(xiàn)通過恢復白血病MDR細胞藥物敏感性以改善治療效果的治療策略有重要意義。

這篇文章中，作者在得到轉錄組測序篩選到的差異表達基因后，集中于“糖代謝”這一主要研究目的，通過差異表達基因在功能和通路上的注釋及富集分析，找到了關鍵的糖代謝相關基因，以及藥敏細胞和耐藥細胞間發(fā)生變化的信號通路，為后續(xù)研究奠定了堅實的基礎。這也是一種高效的轉錄組測序數(shù)據(jù)深入挖掘方法。接下來，小編跟大家一起看看這篇文章吧。

研究背景

葡萄糖是癌細胞中最豐富的能量來源之一。除了食物攝取以外，葡萄糖主要來源是糖異生和糖原分解，屬于葡萄糖合成代謝途徑。相反，線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解是葡萄糖分解代謝的兩條主要途徑。

常氧的正常細胞中，高水平的OXPHOS是細胞ATP的主要來源。然而，近年來發(fā)現(xiàn)，盡管存在充足的氧氣，但許多癌癥仍明顯依賴糖酵解作為一種重要的能量來源，即“有氧糖酵解”或“瓦博格效應”，這已被廣泛認為是代謝重編程的共同特征。此外，有氧糖酵解可能賦予腫瘤細胞以耐藥性，可能的原因有：1）細胞內微環(huán)境酸化，可能會降低藥物吸收和效率；2）支持細胞增殖所需的大分子合成的中間代謝物增加；3）通過減少氧自由基來抗氧化損傷。此外，在化療作用下，腫瘤/白血病細胞可能會表現(xiàn)出額外的代謝重編程，從而獲得對抗腫瘤藥物的耐藥性。

阿霉素（ADM）是一種具有強烈毒性的抗腫瘤藥，臨床上用于治療急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞白血病等。前人研究和作者前期的研究表明，K562/ADM耐藥細胞比其親代K562敏感細胞具有更高的有氧糖酵解活性，這意味著耐藥白血病細胞通過糖酵解重編程獲得了對細胞毒性藥物的適應性。

在此，作者采用二代高通量測序技術對兩個細胞系間的差異表達基因（DEG）進行分析，高度富集的DEG則為候選耐藥性相關基因。糖酵解途徑中，乳酸脫氫酶（LDHA）催化丙酮酸生成乳酸是關鍵步驟，而草酸是一種LDHA抑制劑，可用于抑制有氧糖酵解。用草酸和ADM單獨或聯(lián)合處理后，測定其對細胞活力、ADM細胞毒性、糖代謝和候選耐藥相關DEG表達的影響。

研究方法

1、材料

藥敏細胞系–K562人類白血病細胞系，ADM耐藥細胞系–K562/ADM細胞系。

2、轉錄組測序

兩種細胞系各三個樣本，提取總RNA，構建轉錄組文庫，進行轉錄組測序。

3、體外細胞毒性試驗

4、糖代謝指數(shù)測定試驗

5、Western blot

研究結果

1、轉錄組測序發(fā)現(xiàn)與糖代謝相關的基因

K562/ADM細胞與其親本K562細胞間基因表達譜的比較將為MDR的研究提供有價值的機制見解。藥敏細胞和耐藥細胞的基因表達比較顯示，兩者轉錄組之間存在巨大差異，共檢測到1742個DEG。然后，通過與GO、NR、Swiss-Prot、eggNOG和KEGG數(shù)據(jù)庫的比對，鑒定到了205個與代謝相關的DEG。其中，相比于藥敏細胞，耐藥細胞中有97個基因表達上調、108個基因表達下調，表明這些基因可能在K562/ADM細胞的耐藥性中起重要的作用。

DEG表達量聚類熱圖

作者進一步鑒定了葡萄糖代謝中的酶和轉運體的相關DEG，發(fā)現(xiàn)K562/ADM細胞中GLUT3和GLUT4的基因表達水平較高，這些基因作為葡萄糖轉運體促進葡萄糖的攝取。K562/ADM 細胞中，編碼糖酵解代謝相關酶（PFKM和ALDOC）的基因表達上調，而參與TCA的DH1、IDH2和SUCLG2基因則表達下調。此外在耐藥細胞中，糖異生關鍵酶基因PEPCK1表達下調，糖原分解關鍵酶基因PYGL表達上調，而參與糖原合成的關鍵蛋白基因GYG2表達下調。有趣的是，與前人的蛋白組學研究結果一致，耐藥細胞中PPP通路的關鍵酶G6PD下調。然而，參與嘌呤和胸腺嘧啶合成的關鍵酶PRPS2上調。

結果表明，白血病MDR細胞表現(xiàn)為糖代謝重編程。事實上，在前人和作者之前的工作中，也觀察到與藥敏細胞相比，耐藥細胞的糖酵解通量有所增加。

表1 糖代謝相關DEG

 

此外，KEGG聚類和富集分析顯示，與K562細胞相比，K562/ADM細胞中存在多個生物學過程的變化。為了進一步闡明糖代謝重編程的分子機制，將DEG比對到參與葡萄糖代謝的相關信號轉導途徑。所有DEG都是比對到了信號轉導途徑，如MAPK、PI3K-AKT、HIF、Ras等。如圖，PI3K-AKT通路是DEG富集最多的通路。PI3K-AKT通路通過調節(jié)代謝分子（包括LDHA、HK-II和GLUT）的表達或移位，作為代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵調控因子。結果顯示，PI3K-AKT通路是K562/ADM細胞中最富集的上調通路，與糖代謝重編程和MDR的發(fā)展有關。

葡萄糖代謝的相關信號轉導途徑

2、草酸可以有效恢復K562/ADM細胞對ADM的敏感性

如圖，單獨用草酸處理的兩個細胞系均呈現(xiàn)時間和劑量依賴性細胞毒性，但是細胞毒性相對較低。相比于單獨用ADM處理，用ADM和草酸聯(lián)合處理后，K562細胞和K562/ADM細胞增殖抑制率分別提高了為2.28±0.56倍和6.08±0.77倍，K562/ADM細胞增殖抑制率的增加倍數(shù)明顯高于K562細胞。

這些數(shù)據(jù)表明，盡管耐藥的K562/ADM細胞系對藥物的敏感性不如其親本細胞系，但與草酸聯(lián)合使用時，其療效顯著提高。因此，抑制糖酵解可使K562/ADM細胞恢復ADM敏感性。

草酸和ADM對藥敏、耐藥細胞的影響

3、草酸對糖代謝通量和LDHA活性的抑制作用

在上述試驗中，作者發(fā)現(xiàn)ADM聯(lián)合草酸處理增加了人白血病細胞的細胞毒性。然后，作者研究了草酸對ADM處理的K562和K562/ADM細胞系糖代謝作用的影響，發(fā)現(xiàn)相比于ADM單獨處理，ADM和草酸共同處理48h后，兩個細胞系的葡萄糖消耗和乳酸生成的抑制作用均有所增強。草酸導致兩種細胞系糖酵解抑制呈現(xiàn)劑量依賴性增加，而耐藥細胞糖酵解抑制的變化倍數(shù)更高，這與聯(lián)合處理時耐藥細胞療效升高倍數(shù)更高所一致，說明草酸對糖酵解的抑制導致葡萄糖消耗和乳酸生成的減少，導致白血病細胞對ADM的敏感性增加。

相對LDHA活性檢測結果表明，草酸對K562細胞LDHA活性的抑制作用高于K562/ADM細胞。說明在K562細胞和K562/ADM細胞中，草酸對糖酵解通量的限制作用是不同的，不能用只通過競爭性抑制LDHA活性來解釋，因此草酸抑制LDHA并不是提高ADM療效的唯一機制。

4、草酸抑制ADM誘導的AKT-mTOR-c-Myc通路的過度激活

上述轉錄組測序結果顯示，在K562/ADM細胞中，PIP3-AKT通路上調，此通路是糖代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵調控因子，可能與耐藥性增強有關。此外，草酸對糖酵解的抑制有效提高了K562/ADM細胞的ADM細胞毒性。此外，作者推測草酸誘導的LDHA抑制并不是草酸提高ADM療效的唯一機制。因此，為了研究草酸的使用是否也影響了PIP3-AKT通路，作者用草酸、ADM單獨或聯(lián)合處理K562細胞和K562/ADM細胞后，通過western blot檢測PIP3-AKT通路中一系列重要信號分子的表達水平。

結果表明，草酸逆轉了ADM誘導的K562/ADM細胞中t-AKT和p-AKT473的上調、t-mTOR和p-mTOR的上調。在K562/ADM細胞中，ADM和草酸聯(lián)合處理時顯著下調的AKT-mTOR-HIFα可能導致更有效地抑制AKT-mTOR-c-Myc的過度活化，從而影響ADM耐藥性。而AKT/mTOR/HIF/c- Myc的下游效應物—GLUT4和HK-II檢測結果表明，ADM和草酸聯(lián)合處理后，K562/ADM細胞中的兩種效應物變化趨勢與mTOR相似。

因此，cADM和草酸聯(lián)合處理不僅可以直接競爭LDHA活性，也會中和耐藥細胞中ADM引起的AKT-mTOR-c-Myc通路超活化，以及進一步的AKT-mTOR-HIFα-GLUT4/HK-II受損。

草酸和ADM對PIP3-AKT通路的影響

總結

為了研究有氧糖酵解在白血病耐藥中的分子機制和作用，作者通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)了MDR白血病細胞系K562/ADM與其親本-藥敏細胞系K562的差異表達基因，并對DEG進行聚類和富集分析。采用乳酸脫氫酶抑制劑–草酸評價糖酵解抑制對K562/ADM細胞ADM敏感性及關鍵DEG表達的影響。

作者發(fā)現(xiàn)K562/ADM細胞與K562細胞共有1742個DEG。參與糖代謝的單基因編碼酶的差異表達基因表明，K562/ADM細胞的有氧糖酵解通量較大，而PI3K-AKT信號通路與糖代謝有關，在K562/ADM細胞中表現(xiàn)出明顯上調。草酸通過下調AKT-mTOR通路直接或間接抑制有氧糖酵解，改善ADM在ADM耐藥細胞中的治療效果，并使其重新敏化。

總之，ADM耐藥性是由有氧糖酵解的增加介導的，與MDR白血病細胞中AKT-mTOR-c-Myc通路的過度激活有關。抑制有氧糖酵解和下調有氧糖酵解中的相關信號通路是一種潛在的使得白血病細胞致敏，從而克服MDR的化療策略。

參考文獻
Zhang X , Chen J , Ai Z , et al. Targeting glycometabolic reprogramming to restore the sensitivity of leukemia drug-resistant K562/ADM cells to adriamycin[J]. Life Sciences, 2018.