作者的目的是確定兒童T細胞白血病細胞受阻的發(fā)育階段，并根據(jù)ATAC-Seq確定白血病發(fā)生機制。人健康T細胞的7個發(fā)育階段的染色質可及性圖譜顯示，在T細胞成熟過程中染色質逐漸凝聚。2823個特征性染色質區(qū)域區(qū)分發(fā)育階段的準確性為95%。SAE1周圍的開放染色質被鑒定為最能區(qū)分胸腺發(fā)育階段，表明SUMOylation在T細胞發(fā)育中的潛在作用。利用特征性區(qū)域反褶積顯示，包括那些具有成熟免疫表型的T-ALL，與大多數(shù)未成熟群體相似，這一點被TF結合motif圖譜所證實。作者整合了ATAC-Seq和RNA-Seq，發(fā)現(xiàn)一個與白血病無關的基因DAB1在T-ALLs中過表達、異常剪接和高度可及性。DAB1陰性的患者形成了一個獨特的亞群，具有特別不成熟的染色質譜和SPI1（PU.1）的高度可及性結合位點，SPI1是一種對正常T細胞成熟至關重要的TF?？傊?，我們對染色質可及性和TF結合位點分析表明，兒童T-ALLs細胞與未成熟胸腺前體細胞最相似，表明早期發(fā)育停滯。
英文名稱：Chromatin accessibility landscape of pediatric?T-lymphoblastic leukemia and human?T-cell precursors?
中文名稱：兒童T淋巴細胞白血病和人類T細胞前體的染色質可及性概況
期刊：EMBO Molecular Medicine
IF：8.821
作者：Andreas E Kulozik
單位：德國海德堡大學
時間：2020.8.5
材料與方法
研究結果
1、全基因組染色質可及性在T細胞發(fā)育過程中逐漸發(fā)生變化
使用ATAC-Seq，作者從6名接受心臟手術的健康兒童胸腺中獲得了7個健康T細胞前體（DN2、DN3、ISP、DPCD3–、DPCD3+、SPCD4+和SPCD8+）染色質可及性圖譜（圖1A）。染色質可及性隨著成熟而逐漸減少，并在DP和SP階段達到最小（圖1B）。此外，作者根據(jù)可及性模式的變化將68,415個OCRs分為四種模式（遞增、遞減、波動和穩(wěn)定），并發(fā)現(xiàn)在胸腺細胞成熟過程中，大多數(shù)OCRs（59%）保持穩(wěn)定（圖1C）。作者發(fā)現(xiàn)29%的OCRs可及性變少，只有0.3%可及性增加，這表明發(fā)育中的胸腺細胞的染色質組織特征是關閉/濃縮的，那些區(qū)域在不成熟的前體細胞可及性更高（圖1C）。PCA分析顯示可以根據(jù)發(fā)育階段進行聚類，并顯現(xiàn)出重疊的輪廓，因此表明T細胞成熟過程中染色質的重塑是連續(xù)的過程（圖1D）。
圖1通過ATAC-Seq染色質可及性區(qū)分健康T細胞前體的成熟階段
?2、染色質的發(fā)育階段特異性構象揭示了T細胞發(fā)育的關鍵調控區(qū)域
所有特征區(qū)域聚類熱圖將7個T細胞類群按其成熟的順序聚集在一起，突出了T細胞成熟過程中染色質可及性的持續(xù)變化（圖2A）。連續(xù)發(fā)育階段的逐漸變化導致了DN3和ISP之間的輕度分離，雙陽性階段CD3–和CD3+（圖2A）導致在使用CIBERSORT反褶積算法預測細胞類型預測精度不理想。利用主成分1和2的轉換，量化了特征OCRs的重要性并發(fā)現(xiàn)SUMO1激活酶亞基1上有一個峰（圖2B）。此外，OCRs差異可及性附近有階段性特征已知基因如CD8A和RAG1/2（圖2B）。雙陽性組OCRs在與造血和白細胞分化相關的terms富集，單陽性組在免疫系統(tǒng)調節(jié)相關的terms富集（圖2C）。然而，雙陰性特征峰只富集在一個GO-term即白細胞遷移正調節(jié)（圖2C）。
圖2染色質開放區(qū)域區(qū)分T細胞的發(fā)育階段
3、差異motif富集分析揭示調控T細胞發(fā)育的關鍵轉錄因子
為了增強motif預測的特異性，作者進一步從HINT-ATAC預測候選的轉錄因子結合位點（圖3A）。圖3B中綠色為SPI1、Bach2、IRF1和IRF2。EV5數(shù)據(jù)庫中TFs包括MAF::NFE2、Bach1::Mafk和ETS相關家族TFs（ELF1/4、ELK1/3和ETV3?）（圖3B）。最后。作者確定了7個目前與T細胞發(fā)育無關的TFs（圖3B）。
?圖3 開放的染色質區(qū)域包含成熟的特定的轉錄因子結合motif
4、未成熟的胸腺T細胞前體與T-ALLs共享開放的染色質區(qū)域
29個PDX模型中有7個對應19個T-ALLs患者中的4個（圖4A），之前被證明可以再現(xiàn)原發(fā)性白細胞樣本的染色質可及性，與原始患者相比，ATAC文庫富集在TSS區(qū)域。白血病樣品2,823個細胞特征OCRs PCA分析顯示與健康T細胞分離，將其定位在早期DN2和DN3&ISP發(fā)育階段附近（圖4B）。19例白血病患者中16例早期發(fā)育組DN2和DN3&ISP至少占40%（圖4C）。值得注意的是，即使是被免疫表型分類為成熟的T-ALLs也表現(xiàn)出早期DN2染色質可及性概況的實質性貢獻，表明即使是以成熟免疫表型為特征的T-ALL亞型也類似于未成熟的胸腺前體（圖4C）。通過ATAC-Seq peaks數(shù)量衡量，染色質可及性隨著T細胞的成熟而降低（圖4D）。雖然T-ALLs與早期DN2群體最相似，但是T-ALLs的peaks數(shù)明顯高于分類后的T細胞群（圖4D）。132個早期特異性TF結合位點如Bach1/2、Maf和Nfe212，109個在白血病中顯著富集，然而115個中間和成熟特異性TFs中只有12個在T-ALLs中富集（圖4E）。在T細胞白血病中，以正常DP和SP階段為特征的TFs結合位點motifs趨向減少（圖4E）。
圖4 T-ALL染色質可及性概況與正常人T細胞發(fā)育的不成熟階段最相似
5、與正常人未成熟T細胞相比，T-ALLs染色質可及性更強
T-ALLs中有46,188 OCRs可及性，健康T細胞前體有11,243 OCRs可及性（圖5A）。此外，基于所有OCRs的無監(jiān)督學習PCA分析顯示T-ALLs和健康T細胞明顯分離，表明T-ALLs染色質可及性圖譜與胸腺中健康T細胞完全不同（圖5B）。
6、T-ALLs兩個亞群DAB1和SPI1過表達
由于患者異質性較高（圖5B），作者對每個患者進行了DESeq2差異分析鑒定復發(fā)事件。與健康T細胞前體相比，作者在至少5個T-ALLs中鑒定出292個差異基因和差異可及性OCRs（圖5C）。102個峰/基因可及性強并過表達，191個峰/基因可及性弱并低表達（圖5C）。4例未表達DAB1的患者（P3、P4、P27和P69）形成了一個不同的亞群其特征是SPI1過表達，發(fā)育早期DN2貢獻率特別高（圖4C），3例患者TF SPI1（PU.1）結合位點可及性更高（圖4E）?；虮磉_和染色質可及性差異分析顯示，表達SPI1的患者以基因過表達/超可及性為特征，并決定了T細胞發(fā)育的早期第一階段。這些基因包括MEF2C、MEIS1和HOXA9 ，基因特征為B細胞前體如LYN、BTK、cyclin D2、CD79A、CD79B和CD72（圖5D）。DAB1過表達和超可及性T-ALLs趨向于T細胞發(fā)育后期2和3階段過表達基因如TCF7、LEF1和RUNX1（圖5D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)涉及到DAB1和SPI1一個未知的相互排斥的生物學意義，并將T細胞發(fā)育階段，即兒童T- ALLs可能起源于成熟T細胞發(fā)育途徑的不同層次，盡管早期水平始終一致。
?圖5不同染色質可及性和表達整合分析揭示循環(huán)的特異性表達的基因
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