文獻名稱：Key role for CTCF in establishing chromatin structure in human embryos
期刊：Nature
導讀
在細胞周期的中間階段，染色質(zhì)以分級結(jié)構(gòu)排列在核中，這在調(diào)節(jié)基因表達方面具有重要作用。但是，人類胚胎發(fā)生過程中3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動力學仍然未知。在這里作者報告，與小鼠精子不同，人類精子細胞不表達染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑CTCF，其染色質(zhì)不包含拓撲關(guān)聯(lián)域（TADs）。人類受精后，TAD結(jié)構(gòu)在胚胎發(fā)育過程中逐漸建立。此外，A / B區(qū)室化在人類胚胎2細胞階段中消失，并在后續(xù)胚胎發(fā)育過程中重新建立。值得注意的是，阻斷合子基因組激活（ZGA）可以抑制人類胚胎中TAD的建立，而不能抑制小鼠或果蠅中的TAD。值得注意的是，CTCF在ZGA之前以非常低的水平表達，然后在觀察到TAD時在ZGA階段高表達。CTCF基因被敲除后，胚胎中TAD結(jié)構(gòu)顯著減少，這表明合子基因組激活（ZGA）階段，人類胚胎中的TAD建立需要CTCF表達。結(jié)果表明，CTCF在人類胚胎發(fā)生過程中的3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)建立中具有關(guān)鍵作用。
實驗方法
材料：小鼠精子和桑椹胚
方法：Hi-C, 免疫染色，DNA甲基化測序，ATAC-seq, RNA-seq，Smart-seq2
研究內(nèi)容
1、人類早期胚胎的TAD結(jié)構(gòu)
作者檢測了人類精子和胚胎中的染色質(zhì)相互作用。但是沒有檢測到人類2細胞胚胎中TAD結(jié)構(gòu)的特征性“三角”相互作用。在8細胞胚胎中這些相互作用的水平很低，并且在人類胚胎發(fā)育過程中相互水平逐漸升高（圖1a）。為了排除read深度對分析的影響，在繪制每個階段的相互作用熱圖時，作者隨機選擇了相同數(shù)量的read。 作者進一步調(diào)查了人類胚胎發(fā)育過程中的TAD重編程。使用TAD分離分數(shù)方法（Methods）來獲得TAD結(jié)構(gòu)和TAD邊界。即使read深度很低，也可以檢測到大多數(shù)TAD域。作者還計算了TAD信號和方向指數(shù)。本文的數(shù)據(jù)表明，TAD信號方差和方向指數(shù)在2細胞階段最低，并隨著發(fā)育而逐漸增加（圖1b）。為了排除人胚TAD分析中可能的實驗偏差，本文使用了小鼠morula胚胎作為對照，將其與人2細胞，8細胞和morula胚胎混合。然后，為這些混合樣品構(gòu)建了Hi-C庫。同時，還為未與人類樣品混合的小鼠桑morula胚胎生成了Hi-C庫。這些結(jié)果表明，混合樣品中的TAD結(jié)構(gòu)在人類2細胞胚胎中仍然模糊不清，在8細胞胚胎和桑胚胎中變得更清晰，而所有摻入的小鼠morula胚胎均清晰可見TAD結(jié)構(gòu)。來自混合樣品的TAD信號分析支持了作者的發(fā)現(xiàn)，即TAD結(jié)構(gòu)在人類胚胎發(fā)生過程中得以確立。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，TAD結(jié)構(gòu)在人的2細胞胚胎中基本上不存在，在8細胞胚胎中很少存在，并且在胚胎發(fā)育過程中變得越來越明顯。
圖a 人類精子，人類胚胎和H1人類ES細胞（hESCs）中高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用熱圖，分辨率為40 kb（合并的生物學重復(fù)；n = 2-3）。
圖b 用相等數(shù)量的reads（每個階段從2-3個生物學復(fù)制中產(chǎn)生）計算出的人類胚胎中TAD信號的相對方差。每個點代表一個染色體。顯示P值；雙面Wilcoxon秩和檢驗。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。
圖c 人類胚胎中500kb分辨率的5號染色體的PC1值軌跡和Pearson相關(guān)熱圖，具有相同的read次數(shù)（每個階段2-3次生物復(fù)制）。
圖d 具有相同reads的人胚胎中的compartment強度。數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差，通過自舉獲得（n = 100）。通過單側(cè)t檢驗計算P值。
圖1. 人類精子和胚胎的三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)
2、人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)
先前的研究表明，TAD結(jié)構(gòu)存在于成熟的小鼠精子中。令人驚訝的是，本文沒有在人類精子中觀察到典型的三角TAD結(jié)構(gòu)（圖1a）。例如，人類精子的HOXA簇區(qū)域沒有TAD邊界，但存在于人類胚泡（圖2a）和小鼠精子中。為了驗證該觀察結(jié)果，繪制了人類精子和胚泡在不同讀取深度下的TAD信號方差。與小鼠精子和人類胚泡不同，人類精子系的y截距接近0（圖2b），表明人類精子中不存在TAD。本文進一步比較了人類精子和小鼠精子之間相互作用插入物大小的密度，結(jié)果表明，人類精子在4 Mb（中程）附近出現(xiàn)一個主峰，而小鼠精子在933 kb附近出現(xiàn)肩峰，在41 Mb左右出現(xiàn)遠距離主峰。此外，人的精子和小鼠的精子之間的接觸概率衰減曲線也有差異?？傊?，這些結(jié)果表明人類精子不含TAD。
為了排除潛在的實驗偏見，本文將小鼠精子與人類精子混合，并為精子混合物構(gòu)建了一個Hi-C庫（方法）。平行地，本文混合了人類HeLa細胞和小鼠HT22細胞。與本文之前的結(jié)果一致，本研究在精子混合物中觀察到了來自小鼠精子而非人精子的TAD。相比之下，在人類HeLa細胞和小鼠HT22細胞中均觀察到TAD結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)證實了人類精子中沒有TAD。
CTCF-cohesin復(fù)合物在高級染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有重要作用。本研究調(diào)查了人類和小鼠精子中CTCF和粘著蛋白的水平。RAD21是黏附蛋白復(fù)合物的一個亞基，存在于人類和小鼠的精子中）;但是，在人類精子中未檢測到CTCF，并且在使用短干擾RNA（siRNA）耗盡CTCF的細胞系中表達很弱，但是在小鼠精子，人類和對照小鼠細胞系中檢測到了CTCF（圖2c）。由于CTCF的消耗會導致TAD結(jié)構(gòu)的破壞，因此CTCF的缺乏可能是人類精子中TAD結(jié)構(gòu)喪失的基礎(chǔ)。
圖a 人類精子和胚泡中HOXA簇周圍的相互作用熱圖，分辨率為10 kb（生物學重復(fù); n = 3）。
圖b 人精子和胚泡中TAD信號方差與read深度（1 /讀取次數(shù)）的線性回歸曲線。在y軸上標記了人類胚泡和精子的回歸線的線性外推。在每個讀取深度進行降采樣分析3次（n = 3）。
圖c 用Ponceau染色的小鼠精子，人精子和體細胞系中CTCF的Western印跡。黑色箭頭表示CTCF波段。每個樣品在兩個生物學獨立的重復(fù)樣本上重復(fù)實驗。
圖2. 人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)
3、TAD邊界的建立
TAD結(jié)構(gòu)在人類2細胞胚胎中并不明顯。但是，兩細胞胚胎中的某些區(qū)域顯示出絕緣子結(jié)合的跡象，可以分隔上游和下游相互作用。在胚胎后期，這些區(qū)域大部分成為TAD邊界（圖3a）; 這些區(qū)域因此可以被視為未成熟的TAD邊界。在這項研究中，本研究將未成熟的TAD邊界和成熟的TAD邊界都定義為絕緣邊界。然后，本研究分析了人類胚胎發(fā)育過程中絕緣邊界的動力學。本研究的數(shù)據(jù)表明，分別在2細胞，8細胞，morula 和胚泡階段分別形成635、905、317和306個絕緣邊界（圖3a）。本研究還在小鼠2細胞胚胎中發(fā)現(xiàn)了未成熟的TAD邊界，并確定了小鼠階段獲得的絕緣邊界。比較了人類樣品中2細胞階段的絕緣邊界與胚泡階段的總邊界，結(jié)果表明2細胞邊界與胚泡邊界的30％重疊（圖3b）。本研究的數(shù)據(jù)還顯示ZGA階段包含胚泡中67％的邊界，這與小鼠模型中的比例相似（圖3b）。此外，當將ZGA階段的人類邊界與小鼠的邊界進行比較時，發(fā)現(xiàn)存在明顯的重疊（圖3c）。例如，本研究在人和小鼠的ZGA階段發(fā)現(xiàn)了TTC1和CCNG1基因周圍的絕緣邊界。
接下來，作者試圖確定在早期階段優(yōu)先形成絕緣邊界的基因組區(qū)域。在2細胞階段首先獲得邊界的基因組區(qū)域與持家基因的距離小于在后期階段獲得邊界的邊界區(qū)域的距離（圖3d）。在小鼠胚胎中觀察到了類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，在較早階段獲得的絕緣邊界往往位于人和小鼠的看家基因周圍。作者還發(fā)現(xiàn)邊界附近的管家基因的表達水平傾向于高于其他管家基因的表達水平。
據(jù)報道，重復(fù)元素與細胞系中的TAD邊界相關(guān)。因此，作者分析了胚胎中特定于階段獲得的邊界周圍重復(fù)元件的富集。作者的數(shù)據(jù)表明，在人類早期階段，Alu重復(fù)序列（而不是LINE或MIR重復(fù)序列）（圖3e）富集在絕緣邊界周圍。在小鼠胚胎中觀察到了相似的結(jié)果。例如，在人類或小鼠RAB5A基因周圍的2細胞階段獲得的絕緣邊界被建立在Alu密集區(qū)。此外，作者的數(shù)據(jù)表明AluS元素在2細胞階段獲得的絕緣邊界周圍高度富集（圖3e）。此外，與其他階段相比，在2細胞階段獲得的絕緣邊界周圍的AluS重復(fù)序列在裂解階段得到了高度表達?？傮w而言，這些結(jié)果表明，人類胚胎中絕緣的邊界傾向定位在Alu密集區(qū)周圍。
圖a 絕緣得分的熱圖，以在特定階段（±1 Mb范圍）獲得的絕緣邊界為中心。n，特定階段獲得的絕緣邊界的數(shù)量；b，絕緣邊界中心。
圖b 相對于胚泡邊界數(shù)，每個階段中絕緣邊界數(shù)的累積百分比。
圖c 維恩圖，顯示人ZGA邊界和小鼠ZGA邊界之間的重疊（χ2檢驗）。
圖d 累積分布函數(shù)圖，用于特定階段獲得的邊界與人類胚胎中最接近的管家基因的距離（來自2-3個生物學重復(fù)的合并數(shù)據(jù)）。虛線表示200 kb的距離。P = 3.24×10?8（2單元vs 8單元階段）; P = 9.95×10-8（2細胞期與桑ula鼠比較）; P = 3.83×10-11（2細胞期vs胚泡）;雙面Kolmogorov-Smirnov檢驗。
圖e 在人類胚胎的特定階段獲得的絕緣邊界處AluS元素的富集。
圖3. 在人類胚胎發(fā)育過程中建立絕緣邊界
4、TAD的建立依賴于ZGA以及CTCF調(diào)控染色體
先前的報道表明，TAD的建立獨立于小鼠和果蠅胚胎中的ZGA。作者調(diào)查了這些特征在人類中是否保守。作者用α-amanitin處理人合子以抑制ZGA，并在8細胞階段收集了胚胎。令人驚訝的是，在經(jīng)過α-amanitin處理的8細胞胚胎中，TAD的結(jié)構(gòu)模糊不清（圖4a）。用α-amanitin處理的胚胎中TAD信號的相對方差也顯著低于未處理的8細胞胚胎（圖4b）。因此，在人類胚胎中建立TAD需要ZGA。
接下來，作者旨在鑒定ZGA期間參與TAD建立的蛋白質(zhì)。粘著蛋白復(fù)合物和CTCF在高階染色體結(jié)構(gòu)中具有重要作用。因此，作者研究了這些蛋白質(zhì)表達的差異。粘附蛋白復(fù)合物的亞基，例如RAD21，已經(jīng)在ZGA之前在人類胚胎中高度表達。相比之下，當在人類胚胎中首次觀察到TAD結(jié)構(gòu)時，CTCF的表達在ZGA階段之前非常有限，并且在8細胞階段急劇增加（圖4c）。在經(jīng)α-amanitin處理的8細胞胚胎中，CTCF表達受到抑制。一致地，免疫染色圖像顯示在2細胞核中幾乎未觀察到CTCF蛋白（圖4d）。CTCF明顯存在于未經(jīng)處理的8細胞核中，但在經(jīng)α-amanitin處理的8細胞核中卻不存在（圖4d）。這些結(jié)果表明CTCF表達需要人ZGA。
接下來，作者研究了在人類胚胎中建立TAD對CTCF的需求。作者通過將CTCF siRNA（siCTCF）注入人受精卵來抑制CTCF的表達，并在morula期收集胚胎（圖4d）。值得注意的是，在siCTCF morula中幾乎沒有觀察到三角形TAD結(jié)構(gòu)（圖4e）。相對的TAD信號方差支持抑制siCTCF morula中TAD的建立。一致地，大多數(shù)TAD邊界在對照morula中消失，而在siCTCF morula中變?nèi)?。因此，本研究的?shù)據(jù)表明ZGA期間CTCF表達是人類胚胎中TAD建立所必需的。
圖a 人8細胞和經(jīng)α-amanitin處理的8細胞胚胎中的相互作用熱圖。
圖b 人2細胞（n = 3），8細胞（n = 3）和經(jīng)α-amanitin處理的8細胞胚胎（n = 3）中TAD信號相對方差的箱形圖。方框顯示第25、50和75個百分位，胡須顯示1.5倍的四分位間距。***對于8細胞和α-amanitin處理過的8細胞之間的所有成對比較，校正后的P <0.001（帶有Benjamini-Hochberg多重檢驗校正的雙面Wilcoxon秩和檢驗）。
圖c 人類胚胎發(fā)育過程中CTCF表達的動態(tài)（來自參考文獻22的表達數(shù)據(jù)；每個階段3至20個細胞）。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。RPKM，每百萬個映射讀操作的每千個轉(zhuǎn)錄本的讀操作數(shù)。
圖d CTCF在人類胚胎中的免疫熒光（n = 2-3）。比例尺40μm。
圖e 跟蹤未處理的對照morula和siCTCF morula中的TAD結(jié)構(gòu)，其中覆蓋了基因表達。
圖4. CTCF調(diào)控人類胚胎中染色質(zhì)的建立
總結(jié)
盡管人類和小鼠胚胎都顯示出高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的全基因組重編程，但人類和小鼠胚胎之間的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)存在很大差異。本研究的數(shù)據(jù)為哺乳動物胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的建立提供了寶貴的資源和機制的見解。
文獻下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31801998
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