圖1：無縫克隆流程圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

2. PCR擴增：選擇要擴增的目的片段，在正義鏈和反義鏈的末端分別設(shè)計一條帶有線性化載體正義鏈和反義鏈部分同源序列一致的引物，此處參考說明書建議（15-25bp）。為了減少非特異性擴增，建議與靶序列的匹配度越高越好。

3.電泳：PCR結(jié)果的好壞通常通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察條帶有無或者濃度大小，基本原理是瓊脂糖凝膠介質(zhì)中添加了在紫外下可以顯色的EB, 這種試劑可以嵌合到核酸分子中，與DNA雙鏈結(jié)合，因此，分子量越大的DNA分子，顯色度越高，在相同濃度下也越亮。有的時候如果分子量很小的DNA, 濃度又不高的情況下，DNA條帶有可能會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

4.目的片段的純化（膠回收）：PCR擴增結(jié)束后，體系中可能會有未參與反應(yīng)的聚合酶，Mg²⁺等，所以一般是建議通過純化的步驟將這些雜質(zhì)去除，以利于后續(xù)反應(yīng)的穩(wěn)定進行。

載體線性化：目的片段插入需要將環(huán)狀的質(zhì)粒用酶來消化成線性的雙鏈DNA分子，實際情況下載體消化會因為反應(yīng)時間和酶量多少而有較大區(qū)別，如果用于后續(xù)的基因克隆，建議消化盡量完全。

5.連接反應(yīng)：Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix試劑盒可以將多個片段組合到載體上，形成一個環(huán)狀的重組質(zhì)粒。用于后續(xù)的建庫測序或者誘導(dǎo)蛋白表達。

6.轉(zhuǎn)化：基本原理是質(zhì)粒容易在大腸桿菌中穩(wěn)定繁殖，這部分是基因克隆的關(guān)鍵，如果成功，后續(xù)的平板上會有單克隆的出現(xiàn)。有單克隆出現(xiàn)可以進行下一步實驗。單克隆平板可以在4 ℃冰箱存放一個月，仍然不失效。

7.檢測：挑取帶有抗生素平板單克隆擴大培養(yǎng)，3-4 h, 使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加，隨后用于菌落PCR檢測，是否是插入了目標片段的質(zhì)粒。

小貼士

其他判斷陽性單克隆的方法？

最可靠的方法是酶切，一個環(huán)狀重組質(zhì)粒，在對應(yīng)的位置用限制性內(nèi)切酶雙酶切后，會出現(xiàn)兩個目的片段，如果不能出現(xiàn)兩個片段，一般可以認為是空載體沒有線性消化完全。