哺乳動物生長發(fā)育過程一直是一個經(jīng)典的話題，隨著單細胞技術(shù)發(fā)展，單細胞轉(zhuǎn)錄組研究揭示哺乳動物大腦皮層細胞的異質(zhì)性，但是對于表觀調(diào)控研究還未深入。為了在單細胞水平研究轉(zhuǎn)錄組和表觀調(diào)控的關(guān)系，百邁客可以提供單細胞多組學ATAC&基因表達檢測（scATAC&GEX-seq），真實反映同一個細胞內(nèi)表觀調(diào)控與基因表達內(nèi)在聯(lián)系，確定假定的調(diào)控元件（啟動子，調(diào)節(jié)因子）和它們的靶基因之間的聯(lián)系。此外百邁客業(yè)務(wù)還包括單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、、單細胞免疫組庫等，有興趣的老師可以聯(lián)系當?shù)劁N售。接下來我們看看Nature發(fā)表單細胞水平表觀基因組學研究思路，文章詳情如下：

發(fā)表期刊：Nature

影響因子：49.962

原文鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34616060

發(fā)表日期：2021-10-06

 

摘要

在哺乳動物發(fā)育過程中，染色質(zhì)狀態(tài)的差異與細胞分化相一致，反映了基因調(diào)控圖譜的變化。在大腦發(fā)育過程中，細胞命運和圖譜特征對于定義細胞特征和賦予神經(jīng)發(fā)育障礙選擇脆弱性非常重要。為了確定發(fā)育中人腦的特定細胞類型的染色質(zhì)可及性模式，作者使用了一種單細胞轉(zhuǎn)座酶可及性測序分析方法(scATAC-seq)，對來自人前腦的原始組織樣本進行了測序分析。應(yīng)用無偏估計來識別在神經(jīng)形成過程中經(jīng)歷了廣泛的細胞類型和大腦區(qū)域特異性可及性變化的基因組位點，并應(yīng)用綜合分析來預(yù)測特定細胞類型的候選調(diào)控元件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦類器官包含了大多數(shù)假定的細胞類型特異性增強子可及性模式，但缺乏許多體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細胞類型特異性開放染色質(zhì)區(qū)域。對腦區(qū)域染色質(zhì)可及性進行系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)了大腦皮層神經(jīng)前體細胞之間出人意料的差異，表明視黃酸信號在前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元譜系確定中起著重要作用?？傊?，結(jié)果揭示了染色質(zhì)狀態(tài)對細胞類型多樣性和細胞命運特異性的發(fā)展模式具有重要作用，并評估了腦類器官作為皮層發(fā)育模型的√確度和穩(wěn)定性。

 

背景介紹

大腦皮層的細胞類型通常是根據(jù)少數(shù)形態(tài)學、解剖學和生理學特征進行分類的(圖1)。新興的單細胞轉(zhuǎn)錄學，包括single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)，已經(jīng)能夠大規(guī)模平行分析單個細胞的數(shù)千個分子特征，并揭示了密切相關(guān)的細胞類型之間的差異，例如位于大腦皮層不同區(qū)域的興奮性神經(jīng)元。盡管取得了一些進展，但人大腦皮層中出現(xiàn)不同神經(jīng)元譜系的發(fā)育機制仍然基本未知。
染色質(zhì)狀態(tài)通過調(diào)節(jié)基因調(diào)控元件(如增強子)的可及性來確定基因組的功能結(jié)構(gòu)，這些元件是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點。在發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子的順序級聯(lián)逐漸重塑，并且不同細胞類型呈現(xiàn)出染色質(zhì)可及性的差異化。盡管染色質(zhì)的可及性是細胞特性的一個基本特征，但關(guān)于大腦發(fā)育過程中染色質(zhì)狀態(tài)變化的研究相對較少。目前單細胞基因組學已經(jīng)能夠使用scATAC-seq以細胞分辨率對染色質(zhì)狀態(tài)進行可伸縮分析。在發(fā)育中的小鼠大腦中，scATAC-seq揭示了作為神經(jīng)發(fā)育過程基礎(chǔ)的染色質(zhì)可及性的高度動態(tài)變化。有必要將這些研究擴展到人類初級組織，以便更好地了解非編碼調(diào)控元件(包括人類特有的神經(jīng)發(fā)育增強子)的突變?nèi)绾胃蓴_正常的發(fā)育過程，并導致精神神經(jīng)發(fā)育障礙的遺傳基礎(chǔ)。

圖1：發(fā)育中皮質(zhì)的橫截面示意圖，顯示了主要細胞類型。

發(fā)育中大腦的染色質(zhì)狀態(tài)

為了在單細胞分辨率下觀察發(fā)育中人腦的染色質(zhì)狀態(tài)，作者對6例妊娠中期的人前腦進行了scATAC-seq，包括背外側(cè)前額葉皮層(PFC)、初級視覺皮質(zhì)(V1)、初級運動皮質(zhì)(M1)、初級軀體感覺皮層、背外側(cè)頂葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、島葉皮質(zhì)和內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(MGE)。共有77,354個細胞通過質(zhì)控進行下游分析。scATAC數(shù)據(jù)庫的聚類結(jié)果與并行產(chǎn)生的混合ATAC-seq測序的數(shù)據(jù)高度相關(guān)，并且生物學重復之間的相關(guān)性系數(shù)也很高。對數(shù)據(jù)進行了降維處理與批次效應(yīng)校正。使用Leiden群落檢測算法識別了25個不同的clusters。有力地鑒定了皮質(zhì)和皮質(zhì)下(MGE)兩種不同的細胞類型。

圖2實驗流程與scATAC-seq細胞的細胞類型

使用基因活性分數(shù)來區(qū)分細胞類型，鑒定了多種主要的細胞類型，包括放射狀膠質(zhì)細胞(RGS)、中間前體細胞(IPC)、深層(皮質(zhì)V-VI層)興奮性神經(jīng)元(dlENs)、上層(皮質(zhì)II-IV層)興奮性神經(jīng)元(UlENs)、MGE和CGE來源的皮質(zhì)中間神經(jīng)元(分別為IN-MGES和IN-CGES)、胰島神經(jīng)元、MGE的前體細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)前體細胞（OPCs）、內(nèi)皮細胞以及壁細胞。此外，結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)，使用CellWalker將scATAC-seq細胞與細胞類型匹配。CellWalker以更精細的分辨率識別細胞類型和更廣泛的細胞亞型。此外，作者可以在兩種亞型(TRGS和ORGS)之間識別出不同的開放區(qū)，這兩種亞型分別表達CRYAB和HOPX，這表明scATAC-seq能夠在高分辨率下區(qū)分細胞亞型，具有更高的靈敏度。

圖3細胞類型標記基因的特異性

識別特定細胞類型的增強子

為了確定候選的基因調(diào)控元件，從每種細胞類別中找出總的單個細胞的開放區(qū)。將重疊的開放區(qū)合并，總計459,953個開放區(qū)。對基因組中開放區(qū)進行注釋，其在基因內(nèi)含子和遠端基因間隔區(qū)以及轉(zhuǎn)錄起始點附近區(qū)域富集。將開放區(qū)與Roadmap Epicenomics 25-state chromatin model相交，發(fā)現(xiàn)啟動子和增強子state強烈富集，以及轉(zhuǎn)錄、異染色質(zhì)和靜止state的耗盡。每種細胞類型確定了特定于細胞類型的差異可及的開放區(qū)，共有265,123個開放區(qū)，大多數(shù)細胞類型具有數(shù)千個特異的開放區(qū)。此外，還確定了八個大腦區(qū)域之間可區(qū)別訪問的開放區(qū)信號值。

為了鑒定候選增強子，整合了ATAC-seq、CUT&Tag、Hic和基因表達數(shù)據(jù)，并使用接觸活性算法來預(yù)測所有類型的皮質(zhì)細胞的增強子-基因相互作用。共預(yù)測了25,659個基因連鎖增強子。其中在發(fā)育中的人皮層分離的細胞上進行了染色質(zhì)免疫沉淀和測序(PLAC-seq)，發(fā)現(xiàn)了67,493個開放區(qū)以及10,050個預(yù)測的增強子，這些開放區(qū)和預(yù)測的增強子與預(yù)測的細胞類型特異性增強子相關(guān)的基因被富集。為了進一步驗證注釋的z確性，將開放區(qū)與從人類皮質(zhì)組織樣本生成的公開可用數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。發(fā)現(xiàn)scATAC-seq鑒定到了混合測序數(shù)據(jù)注釋的大多數(shù)開放區(qū)，并且還鑒定了許多在混合數(shù)據(jù)中未預(yù)測的細胞類型特異性peaks，特別是富集在諸如小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞的稀有細胞群體中的開放區(qū)。在功能驗證的前腦增強子中，大多數(shù)(319個中的304個)與染色質(zhì)可及性開放區(qū)重疊，但只有67個重疊的增強子是通過激活接觸方法進行預(yù)測。總之，這些分析表明，scATAC-seq是一種從異質(zhì)組織樣本中檢測染色質(zhì)可及性模式的可靠方法。然而，預(yù)測的增強子與以前發(fā)表的研究的有限重疊表明，迫切需要更好地理解預(yù)測調(diào)控潛力的計算機算法的相關(guān)特征。

為了確定細胞類型的調(diào)節(jié)“語法”，計算了已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序在細胞類型特異的開放區(qū)中的富集。轉(zhuǎn)錄因子基序的富集與標記基因富集的細胞類型注釋密切相關(guān)。為了在單細胞水平上檢查轉(zhuǎn)錄因子基序的富集，作者還使用了ChromVAR(方法)，發(fā)現(xiàn)每個cluster的排列靠前的基序富集基本一致。這些發(fā)現(xiàn)確定了scATAC-seq在不同細胞類型中識別出與已知轉(zhuǎn)錄因子表達模式一致的染色質(zhì)可及性模式，并為發(fā)現(xiàn)細胞圖譜和細胞命運的轉(zhuǎn)錄因子編碼提供了路徑。

圖4 不同細胞類型、原始scATAC-seq細胞中每個區(qū)域的特異性peaks以及預(yù)測增強子-基因相互作用

調(diào)控區(qū)突變引發(fā)的疾病風險

不同發(fā)育階段和分化狀態(tài)的染色質(zhì)狀態(tài)的細胞分辨率數(shù)據(jù)可能提供突變和發(fā)育中的不同細胞類型選擇性脆弱性之間的聯(lián)系。為此，研究者將特定細胞類型的ATAC-seq peaks和預(yù)測的增強子與疾病相關(guān)的常見和罕見的非編碼突變體記性關(guān)聯(lián)分析。首先分析了細胞類型特異性的peaks sets、預(yù)測的增強子、啟動子相互作用區(qū)域與基因組區(qū)域重疊的peaks值，這些區(qū)域在發(fā)育遲緩的個體中富集了拷貝數(shù)變異；結(jié)果發(fā)現(xiàn)dlEN、內(nèi)皮/壁層和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性peaks顯著富集，以及中間神經(jīng)元中重疊啟動子相互作用區(qū)的peaks顯著富集。

由于這些區(qū)域不提供針對單個調(diào)控元件或基因的特異性，所以又測試了特定細胞類型的peaks、預(yù)測的增強子以及與ASD、神經(jīng)發(fā)育延遲(NDD)相關(guān)基因附近區(qū)域的啟動子相互作用區(qū)域重疊peaks的富集情況，并發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)細胞類型中這些區(qū)域顯著富集或缺失。還對ASD和NDD患者的細胞類型特異性peaks和預(yù)測的DNMs的增強子進行了比較分析；但與同胞家系相比，在先證者中注釋的DNMs沒有顯著富集。此外，將預(yù)測的增強子與包含神經(jīng)發(fā)育疾病相關(guān)基因的拓撲結(jié)構(gòu)域(TADS)相交，發(fā)現(xiàn)在幾種細胞類型的TADS中有顯著的共定位。

最后，研究者評估了在預(yù)測的每種細胞類型的增強子中與神經(jīng)精神疾病風險相關(guān)的常見變異的富集程度。對精神分裂癥、ASD、重度抑郁癥和雙相情感障礙進行了部分遺傳連鎖不平衡(LD)回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與精神分裂癥相關(guān)的常見突變的興奮性和抑制性神經(jīng)元增強子富集。總而言之，細胞類型特異性染色質(zhì)狀態(tài)數(shù)據(jù)有可能在皮質(zhì)發(fā)育過程中確定特定的調(diào)控程序，這些程序很有可能導致神經(jīng)發(fā)育障礙，特別是提高的疾病相關(guān)的突變。

圖5：scATAC-seq peaks中疾病相關(guān)變異的富集和耗盡

神經(jīng)發(fā)生中染色質(zhì)的動態(tài)變化

為了更好地理解轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組變化如何在神經(jīng)發(fā)生過程調(diào)節(jié)細胞命運，聯(lián)合分析了來自視覺皮質(zhì)的相關(guān)細胞類型的scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)?；虮磉_和基基因活性在共嵌空間的預(yù)測顯示，不同細胞類型分群不受特征模式的影響。為了確定興奮性神經(jīng)元分化和成熟后的染色質(zhì)可及性軌跡，在共嵌空間對細胞進行了擬時間排序，恢復了已知的興奮性神經(jīng)元分化的細胞類型的發(fā)育序列。發(fā)現(xiàn)了超過25000個開放區(qū)，在擬時間內(nèi)具有瞬時可及性，包括超過5000個預(yù)測的增強子，其中許多與細胞類型識別相關(guān)的基因相互作用。

圖6：人腦皮層神經(jīng)發(fā)生過程中染色質(zhì)可及性的動態(tài)變化

區(qū)域特異性染色質(zhì)狀態(tài)

在神經(jīng)發(fā)生的早期，出現(xiàn)了特定區(qū)域類型的皮質(zhì)興奮性神經(jīng)元，但在不同區(qū)域的前體細胞之間只發(fā)現(xiàn)了有限的轉(zhuǎn)錄差異。調(diào)控元件的可及性變化通常先于基因表達。研究者比較了頭-尾軸兩端、PFC和V1的興奮性譜系細胞的scRNA-seq和scATAC-seq圖譜。在每種模式中，對細胞進行擬時間分析，確定分化軌跡，并沿著該軌跡確定PFC和V1譜系之間轉(zhuǎn)錄或染色質(zhì)狀態(tài)差異變得明顯的“分支點”。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了興奮性神經(jīng)元的區(qū)域特異性分群不同的是，染色質(zhì)狀態(tài)特征表明PFC和V1中間前體細胞群體之間存在顯著差異。在轉(zhuǎn)錄水平上，PFC和V1IPCs只有少數(shù)幾個基因有差異表達，而染色質(zhì)可及性分析發(fā)現(xiàn)這些細胞類型之間有1800多個差異可及區(qū)。

為了確定可能導致PFC和V1譜系分化的調(diào)控程序，又對PFC和V1細胞之間可區(qū)分的開放區(qū)進行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點富集分析。該分析鑒定了幾個轉(zhuǎn)錄組研究預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子。該分析還在PFC細胞中發(fā)現(xiàn)了視黃酸(RA)信號通路的組成部分——在妊娠中期的PFC中RA活性增加。

圖7：祖細胞染色質(zhì)狀態(tài)的區(qū)域差異預(yù)示著區(qū)域特異性興奮神經(jīng)元的出現(xiàn)

視黃酸在大腦皮層區(qū)域化中的作用

在哺乳動物大腦發(fā)育的過程中，視黃酸信號在神經(jīng)組織中發(fā)揮著重要的作用。為了測試RA是否促進人類PFC的分化，在含有或不含有維生素A(RA合成的前體)的情況下培養(yǎng)皮質(zhì)類器官。同時利用DEAB(一種有效的RA合成抑制劑)處理與維生素A一起培養(yǎng)的腦類器官。在分化的第10周，此時深層神經(jīng)正在發(fā)生，利用scRNA-seq分析了腦類器官。發(fā)現(xiàn)在維生素A存在下培養(yǎng)的興奮性前腦神經(jīng)元與不含維生素A或在DEAB存在下培養(yǎng)的腦類器官的神經(jīng)元是分開聚類的。還發(fā)現(xiàn)了區(qū)分PFC和V1皮層神經(jīng)元的信號。利用目前的分類方法注釋類器官神經(jīng)元中的PFC和V1神經(jīng)元的特征；與未使用維生素A培養(yǎng)或使用DEAB處理的神經(jīng)元相比，維生素A培養(yǎng)的類器官中PFC類似神經(jīng)元的比例始終較高。免疫染色證實了基因產(chǎn)物的差異表達，并發(fā)現(xiàn)與含有維生素A培養(yǎng)的腦類器官的PFC特性一致。這些發(fā)現(xiàn)表明，RA信號通路有助于人類皮質(zhì)發(fā)育過程中PFC神經(jīng)元譜系的發(fā)育。

圖8：視黃酸在發(fā)育中的皮質(zhì)PFC-V1分裂的作用

基準測試腦類腦類器官

由于人體原代組織比較稀缺，對人類神經(jīng)發(fā)育的研究需要合適的體外模型，如腦類器官。之前單細胞轉(zhuǎn)錄組學和整體表觀基因組學強調(diào)了大腦類器官細胞與體內(nèi)同類細胞之間的相似性。利用三個遺傳正常的樣本在三個分化時間點的23,555個皮質(zhì)類器官細胞進行了scATAC-seq。為了驗證所產(chǎn)生的細胞系，從來自同一細胞系的類器官中生成了scRNA-seq數(shù)據(jù)，并進行了平行培養(yǎng)，結(jié)果表明所有細胞系都表達FOXG1和主要細胞類型的標記。scATAC-seq數(shù)據(jù)中確定了主要的細胞類型，但是單個分群包含的細胞類型特異性開放區(qū)比來自原代細胞少。隨后，通過從原代細胞的開放區(qū)量化了類器官細胞之間的染色質(zhì)可及性。在原代細胞中共確定了459,953個開放區(qū)，然而在類器官只確定了239,661個開放區(qū)。隨后又發(fā)現(xiàn)在類器官中未檢測到包括小膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和OPCs等細胞類型的特定開放區(qū)。當從分析中去除這些開放區(qū)的peaks信號后，在類器官開放區(qū)中尚未發(fā)現(xiàn)V1興奮神經(jīng)元富集。然而，除了小膠質(zhì)細胞增強子外，大多數(shù)(超過80%)的預(yù)測增強子都存在于類器官中。還鑒定了在原始細胞中沒有發(fā)現(xiàn)的109,960個類器官開放區(qū)。

圖9：腦類器官和原代組織的peaks比較揭示染色質(zhì)圖譜的顯著差異

討論

在這項研究中，分析了發(fā)育中的人腦中單個細胞的染色質(zhì)狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個追蹤神經(jīng)元分化的瞬時可及位點。這些狀態(tài)可能揭示了在神經(jīng)發(fā)生過程中控制細胞命運建立的機制，將它們與來自成人大腦的數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，可能使表觀基因組神經(jīng)發(fā)育軌跡的完全重建成為可能。與以前的研究一致，與疾病變異相關(guān)的染色質(zhì)與神經(jīng)精神障礙發(fā)病中的有絲分裂期后發(fā)育的皮質(zhì)興奮性神經(jīng)元相關(guān)。未來需要探索這些調(diào)控區(qū)域中的疾病相關(guān)變異如何改變發(fā)育中的皮層中的細胞命運。通過比較發(fā)育過程中不同皮層區(qū)域(V1和PFC)的調(diào)控情況，發(fā)現(xiàn)了不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，它們在這兩個譜系之間存在差異富集。該結(jié)果擴展了RA信號在前腦發(fā)育中的作用，表明RA信號有助于人類PFC興奮性神經(jīng)元的發(fā)育。RA信號調(diào)節(jié)失調(diào)與一系列神經(jīng)發(fā)育和精神疾病有關(guān)，因此該研究結(jié)果可能促進對這些疾病的研究。

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