近幾年國家自然科學基金資助項目中，免疫調控項目占比年年創(chuàng)新高，從2022年國自然公布的情況來看，免疫調控依舊是國自然的重點、熱點領域。機體用來防御感染和疾病的免疫系統(tǒng)在免疫調節(jié)過程中，通過免疫器官、免疫細胞細胞、免疫活性物質以及其它系統(tǒng)之間組成復雜的調控網絡機制，來維持機體的穩(wěn)定，免疫系統(tǒng)的紊亂與調節(jié)機制也就成為了醫(yī)學和生命科學研究中的熱門領域。

免疫系統(tǒng)分為固有免疫和適應性免疫，固有免疫是機體在發(fā)育和進化過程中形成的天然免疫防御功能，也稱為非特異性免疫；與此相對應的是適應性免疫，指出生后通過與抗原物質接觸所產生的一系列防御功能，包括B細胞介導的體液免疫應答和T細胞介導的細胞免疫應答，免疫應答主要依賴于B細胞受體（B Cell Recptor, BCR）和T細胞受體（T Cell Recptor, TCR）識別多種多樣的抗原分子，發(fā)揮功能清除病原體或體內腫瘤細胞，BCR和TCR基因中產生巨大的序列變異，可以創(chuàng)造大量的具有不同免疫受體和抗原特異性的淋巴細胞。因此在單細胞水平分析免疫微環(huán)境細胞組成、表達模式、生物學功能及細胞間相互作用模式等特征，可以更深入了解免疫系統(tǒng)調節(jié)機制，而單細胞免疫組庫技術就是在解析免疫微環(huán)境特征的同時，還能揭示T/B淋巴細胞抗原受體多樣性，為適應性免疫應答過程的探索提供更清晰的視角。

研究進展

免疫學是現代醫(yī)學的一個主要領域，是許多重要科學的研究熱點和醫(yī)學突破的前沿，免疫細胞參與人體多器官疾病的發(fā)展，對免疫信號傳導、免疫細胞遷移和免疫組庫的詳細了解有助于開發(fā)新的治療方法來對抗各種疾病，識別與這些疾病發(fā)生密切相關的免疫細胞，可以進一步發(fā)現這些疾病的分子機制。利用單細胞免疫組庫技術，基于大量的單細胞基因表達和克隆型的多樣性數據，可以提供細胞表達特征聚類、亞群表達特征的分析、標志物篩選等方面的分析，揭示免疫組庫克隆性、多樣性、抗原特異性和細胞微環(huán)境[1]，目前已廣泛應用在基礎免疫學研究、自身免疫性疾病、移植與免疫重建、腫瘤免疫與治療、傳染病及疫苗研發(fā)等研究領域。

1)利用單細胞免疫組庫技術，追蹤適應性免疫系統(tǒng)的發(fā)育與建立，如探究胸腺器官發(fā)育圖譜、解析不同發(fā)育時期V(D)J重組特征；探索健康和疾病狀態(tài)下免疫系統(tǒng)的基本生物學，重新定義免疫細胞類型和分子特征，解析疾病進展中免疫失調特征；

2)利用單細胞免疫組庫技術，理解腫瘤與免疫的相互作用，尋找惡性腫瘤免疫治療的潛在靶點；揭示移植體抗宿主病背后的生物學機制，為免疫調節(jié)治療提供潛在方向；破譯錯誤導向免疫應答的機制，解析免疫耐受機制與免疫應答動態(tài)調節(jié)之間的復雜相互作用；

3）利用單細胞免疫組庫技術，表征腫瘤患者對免疫檢查點阻斷的應答，篩選獲益人群；改造T細胞開發(fā)新的癌癥免疫治療策略（CAR-T、TCR-T細胞療法）；了解疫苗接種后的抗體應答，助力疫苗開發(fā)…..

免疫調控應用案例

利用單細胞免疫組庫技術，探索健康和疾病狀態(tài)下免疫系統(tǒng)的基本生物學,鑒定人體內的免疫細胞身份、功能和組織，并應用到免疫學的各個領域，包括分析新興病原體、開發(fā)疫苗、開發(fā)免疫腫瘤學療法、認識自身免疫疾病及實施安全的器官移植等。

01、繪制組織免疫圖譜

免疫調控應用案例1、單細胞免疫組庫分析揭示人組織特異性免疫特征[2]

標題：Cross-tissue immune cell analysis reveals tissue-specific features in humans

期刊名稱：Science

影響因子：63.714

發(fā)表時間：2022年5月

樣本設計：2個成人捐獻者的16份組織樣本，分別進行scRNA、scTCR、scBCR，實驗中采集的組織樣本包括初級淋巴器官（骨髓）和次級淋巴器官（脾、肺引流和腸系膜淋巴結）、粘膜組織（腸和肺）以及血液和肝臟等非淋巴組織，還包括胸腺、骨骼肌和網膜。

研究內容：目前對于人體組織中免疫細胞的分型仍知之甚少，無法快速精準地對免疫細胞進行分型。本研究通過單細胞免疫組庫測序對16份組織類型樣本進行分析，得到了357,211個單細胞數據，其中329,762個細胞都是免疫細胞，確定了43個細胞特異性的細胞亞群，構建了人類跨組織的免疫細胞圖譜，揭示了已知免疫細胞類型在不同組織微環(huán)境中的分布情況，并解析了人類免疫系統(tǒng)的組織特異性以及豐富的T細胞和B細胞克隆型，同時開發(fā)了CellTypist細胞類型自動注釋平臺。

免疫調控應用案例2、人類胸腺發(fā)育細胞圖譜揭示了T細胞組庫的形成[3]

標題：A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation

期刊名稱：Science

影響因子：41.845

發(fā)表時間：2020年2月

樣本設計：共采集了15個胎兒胸腺（從7-17孕周）和9個出生后至成人期的胸腺樣本，4、8和24 w孕周小鼠胸腺樣本，并根據CD45、CD3和EpCAM表達對分離的流式分選富集免疫細胞和非免疫細胞、T細胞、上皮細胞，進行scRNA-seq + scTCR-seq。

研究內容：胸腺是T細胞發(fā)育和TCR形成的重要器官，塑造了機體的適應性免疫，T細胞的胸腺內發(fā)育有空間協(xié)調性，受胸腺微環(huán)境多種細胞類型的精細調節(jié)，但目前尚缺少一份完整的人類胸腺圖譜幫助理解人體免疫系統(tǒng)。本研究繪制了胸腺單細胞時空圖譜，描繪了胸腺來源T細胞的多樣性以及構成胸腺微環(huán)境的細胞空間定位；在單細胞分辨率下重建T細胞發(fā)育軌跡，揭示了人 TCR 免疫組庫形成和選擇的偏倚特征，提示了人體如何應對不同的抗原挑戰(zhàn)；最后，提供了人類和小鼠胸腺細胞圖譜之間的系統(tǒng)比較。

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02、解析疾病機制

免疫調控應用案例3、單細胞免疫組庫揭示了川崎病發(fā)病和治療過程中外周免疫細胞動態(tài)變化[4]

標題：Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease Patients

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2021年9月

樣本設計：7名急性KD患者接受靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）治療前、后，3例年齡匹配的健康對照，取新鮮外周血PBMC樣本，進行scRNA+scTCR+scBCR測序。

研究內容：川崎?。↘D）是一種急性全身性發(fā)熱性疾病和兒童期血管炎，可導致冠狀動脈病變，已成為許多發(fā)達國家兒童獲得性心臟病的常見原因。盡管已經報道了免疫細胞的功能和表型變化，但對急性KD全局免疫反應的理解尚不清楚。本研究通過對IVIG治療前后的KD患者PBMC樣本進行單細胞免疫組庫測序，發(fā)現了CD8+T細胞在治療后的特異性克隆擴增，提示是常規(guī)抗原而非超抗原可能是KD發(fā)病機制的原因，CD8+T相關細胞的比例是川崎病的重要風險因素；研究繪制了川崎病外周血單細胞免疫圖譜，揭示了川崎病治療前后及對照中PBMC各類型免疫細胞比例、基因表達、免疫反應、生物學功能以及細胞表面受體的變化。

免疫調控應用案例4、單細胞免疫組庫揭示鼻咽癌微環(huán)境中基質細胞與腫瘤細胞特征[5]

標題：Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2021年9月

樣本設計：11例鼻咽癌患者的腫瘤樣本和3例非惡性鼻咽淋巴增生的樣本，進行scRNA+scTCR+scBCR測序。

研究內容：鼻咽癌的病理學特征表現為腫瘤內部和附近經常被成分復雜的免疫細胞所浸潤，這種微環(huán)境特征在理論上表明了免疫治療在鼻咽癌中具有極高的潛力。然而在I期和II期臨床試驗中，鼻咽癌患者對免疫療法的反應率僅有 20%-30%，表明鼻咽癌微環(huán)境中細胞異質性和動態(tài)功能需要進一步精準解析，從而優(yōu)化針對鼻咽癌的精準治療。本研究利用單細胞免疫組庫技術系統(tǒng)地對比了鼻咽癌腫瘤微環(huán)境和非惡性鼻咽微環(huán)境的構成和功能狀態(tài)，發(fā)現初始B細胞、記憶性B細胞和效應B細胞和鼻咽癌患者的預后呈顯著正相關，雙陰性B細胞則和鼻咽癌患者的預后呈顯著負相關，成為預測鼻咽癌患者預后的潛在生物標記物；耗竭T細胞高度表達 CXCL13，可能是招募 CXCR5⁺?B細胞并促進三級淋巴結構形成的重要分子機制，可能是影響B(tài)細胞在鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中浸潤程度的因素之一；該研究發(fā)現了與鼻咽癌患者預后相關的特征基因和細胞亞群，從而為研究鼻咽癌微環(huán)境中的分子機制和優(yōu)化鼻咽癌精準治療提供了分子生物學上的依據。

免疫調控應用案例5、單細胞免疫組庫揭示多發(fā)性硬化癥新機制[6]

標題：Bone marrow hematopoiesis drives multiple sclerosis progression

期刊名稱：Cell

影響因子：66.850

發(fā)表時間：2022年6月

樣本設計：MS患者及健康對照各7例，取骨髓樣本，進行scRNA-seq+scTCR-seq。

研究內容：多發(fā)性硬化癥（MS）是一種T細胞介導的中樞神經系統(tǒng)自身免疫性疾病，也是一種伴隨終生的神經退行性疾病，T細胞失去自身免疫耐受是MS癥狀的核心機制，骨髓作為中樞免疫器官和造血器官，對維持外周和中樞的免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用，但其對MS疾病進展的影響還不清楚。本研究利用單細胞免疫組庫測序、流式細胞術及譜系追蹤分析了MS患者在疾病活動期骨髓造血系統(tǒng)的特征，與健康對照組相比，MS患者的造血干細胞、祖細胞及髓系細胞數量顯著增加，骨髓T細胞克隆數量和多樣性明顯增加；MS小鼠模型骨髓微環(huán)境的趨化因子CXCL12驅動自身反應性T細胞大量進入骨髓，在到達骨髓后高度表達趨化因子CCL5，從而引起髓系增生，為治療MS提供了新思路–通過再平衡骨髓造血系統(tǒng)，回歸免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，從而減輕神經系統(tǒng)炎癥損傷。

03、臨床應用

免疫調控應用案例6、單細胞免疫組庫揭示腎透明細胞癌組織駐留T細胞與免疫治療療效[7]

標題：Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy

期刊名稱：Cancer Cell

影響因子：38.585

發(fā)表時間：2021年5月

樣本設計：6例接受和未接受ICB治療的腎透明細胞癌（ccRCC）患者癌組織、淋巴結、癌旁組織和血液PBMC，共29個樣本，進行scRNA-seq?+ scTCR-seq。研究內容：ccRCC具有高度免疫浸潤性，免疫檢查點阻斷（ICB）治療和聯(lián)合方案顯著提高ccRCC患者的生存率，但免疫異質性對于鑒定更有效的ccRCC治療靶標及預測響應水平的生物標志物產生了干擾。本研究針對免疫治療前后ccRCC組織和PBMC樣本分別進行單細胞免疫組庫測序分析，構建了167,283個細胞基因表達圖譜和43,828個細胞的TCR克隆型圖譜，共鑒定到28個細胞亞群；構建了167,283個細胞基因表達圖譜和43,828個細胞的TCR克隆型圖譜，共鑒定到28個細胞亞群，繪制ccRCC的多區(qū)域免疫異質性圖譜；TCR克隆序列相似性分析，發(fā)現ICB耐藥組高擴增克隆型間克隆序列存在高度相似性；TCR分化軌跡分析，發(fā)現在ICB響應組CD8+組織駐留T細胞與NK樣細胞存在相互轉化軌跡；結合TCGA多隊列免疫治療數據分析，驗證了CD8+組織駐留T細胞的預后價值，能夠一定程度上預測免疫治療的療效。

免疫調控應用案例7、單細胞免疫組庫技術發(fā)現潛在的SARS-CoV-2中和抗體[8]

標題：Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’?B Cells

期刊名稱：Cell

影響因子：36.216

發(fā)表時間：2020年5月

樣本設計：從12個COVID-19康復患者的外周血單核細胞PBMC中分離B細胞，對B細胞和CD27⁺記憶B細胞進行scRNA-seq + scBCR-seq，獲得IgG1亞型抗體，并進行抗體體外檢測和篩選。

研究內容：針對新冠病毒人源單克隆抗體的分離鑒定的方法，如單個記憶 B 細胞的克隆擴增，通常用于從異質B細胞群體中獲得免疫球蛋白輕重鏈RNA序列，以產生單克隆抗體，但由于耗時的孵化和篩選步驟，使該技術至少需要幾個月才能完成成功的篩選。本研究利用單細胞免疫組庫技術對60名新冠病毒感染恢復期患者富含抗原的B細胞進行分析，從8,558種抗原結合 IgG1+克隆型中鑒定出了14種有效的中和抗體，其中強效的BD-368-2在SARS-CoV-2感染的 hACE2轉基因小鼠中也顯示出強大的治療和預防功效；研究證明了通過B細胞的單細胞高通量測序技術可以大大縮短抗體的篩選周期，有效發(fā)現人源中和單克隆抗體，為新冠病毒以及未來大流行病的抗體疫苗研發(fā)提供了非常重要的科學和實用價值。

免疫調控應用案例8、單細胞轉錄組聯(lián)合TCR-seq解析了腫瘤抗原特異性T細胞及生物標志物鑒定[9]

標題：Defined tumor antigen-specific T cells potentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of?immunotherapy response

期刊名稱：Cell Research

影響因子：46.297

發(fā)表時間：2022年6月

樣本設計：通過scRNA-seq、scTCR-seq和體外新抗原刺激，對腫瘤及其鄰近組織中的T細胞進行了全面解析。

研究內容：針對腫瘤特異性抗原（TSA）的個性化免疫療法可以在不損害正常組織的情況下產生有效和安全的抗腫瘤免疫反應，盡管新抗原疫苗已在臨床試驗中顯示出治療效果，但從腫瘤突變中預測新抗原仍然具有挑戰(zhàn)性，宿主抗腫瘤免疫反應選擇并激活識別腫瘤抗原的T細胞；因此用來自患者體內這些天然存在的腫瘤抗原特異性T（Tas）細胞的T細胞受體改造的T細胞將靶向患者腫瘤中的TSA。本研究揭示了Tas 細胞的特點是腫瘤富集、腫瘤特異性克隆擴增和新抗原特異性；評估了腫瘤中Tas細胞標記物CXCL13的表達水平可能比來自免疫周期早期步驟的標志物（如TMB）更jing q 地預測對ICB 的反應；并將CD200和ENTPD1分別鑒定為CD4+和CD8+Tas細胞的表面標志物。

百邁客項目經驗

免疫器官可分為中樞免疫器官和外周免疫器官，免疫器官分為中樞免疫器官和外周免疫器官，前者包括胸腺和骨髓，是免疫細胞形成和分化成熟的場所；后者包括淋巴結、脾臟、扁桃體、闌尾、腸集合淋巴結、呼吸道和消化道黏膜下層等淋巴組織，是T/B淋巴細胞定居、增殖的場所及發(fā)生免疫應答的主要部位。兩者則主要是通過血液循環(huán)及淋巴循環(huán)相互聯(lián)系，從目前發(fā)表的10x單細胞免疫組庫文章樣本類型數目統(tǒng)計來看，外周血和相關免疫器官的免疫多樣性特征研究是主要聚焦方向。

百邁客自2019年推出單細胞免疫組庫測序服務后積累了大量的項目經驗，目前累計已完成1000+個樣本的分選富集，包含25+種組織類型，涉及疾病類型超40+種，包含結直腸癌、白血病、皮膚病、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、宮頸癌、鼻咽癌、黑色素瘤等。

與圖2展示的類似，百邁客實測項目中血液樣本數量很多，占比超60%；血液樣本相較于組織樣本，無需進行細胞解離，能夠避免細胞解離引起的細胞活性受損、細胞類型丟失等問題；尤其是臨床樣本，往往涉及到組織樣本獲取難度大的問題，患者治療后腫瘤組織取樣更是很多老師的困擾，因此取配對的血液樣本就成了一個合適的替代方案，在臨床監(jiān)測、標志物診斷方面更是具有巨大的優(yōu)勢。

Tips：對于血液樣本，送樣量2-3mL即可，推薦選擇上門服務；如果需要寄送，可用EDTA紫色抗凝管保存，24h內寄送到百邁客實驗室分離PBMC上機；或者分選完PBMC后加細胞凍存液梯度凍存，干冰寄送。

小結

通過單細胞免疫組庫測序，構建組織/疾病高分辨率細胞異質性圖譜，全面解析基因表達及免疫組庫多樣性，挖掘與疾病發(fā)生發(fā)展相關的關鍵細胞亞群和信號通路變化、克隆型擴增，為鑒定預后診斷分子標記物、優(yōu)化升級癌癥免疫治療療法、開發(fā)抗體/疫苗等臨床應用提供強有力的基礎。

百邁客單細胞空間多組學平臺

百邁客同時具有百創(chuàng)DG1000和10x Genomics單細胞測序服務平臺、百創(chuàng)S1000和10x Genomics空間測序服務平臺，百創(chuàng)S1000空間測序技術更是“亞細胞級分辨率”和“微孔”結合的原位捕獲空間測序技術，其獨立設計的Spatial Barcode還可以高度適配Oxford Nanopore Technologies（ONT）平臺，助力國產化空間測序技術進入新的時代。

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