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 分類: 醫(yī)學研究, 時空組學

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標題:Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM

發(fā)表雜志:EBioMedicine(IF=11.205)

發(fā)表時間:202209

研究背景

膠質母細胞瘤(GBM)是具有侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤類型,通常對目前的治療具有耐藥性,以腫瘤微環(huán)境為中心的療法可能為GBM治療帶來新的希望。因此,迫切需要深入了解腫瘤-基質通訊,以確定有希望的治療靶點。

研究方案設計

1、收集人、小鼠GBM的單細胞RNA測序(scRNA-seq)數據、RNA-seq數據和空間轉錄組(Spatial transcriptomics,ST)數據;

2、免疫細胞分選

1)小鼠脾臟T cells:EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ;

2)單核細胞:RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)沖洗股骨和脛骨,40μm濾器過濾,EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分選.;

3)CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells:anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。

3、流式分選:小鼠GBM細胞懸液抗體孵育30 mins,anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies對照;

4、免疫熒光:anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。

5、細胞共培養(yǎng):前神經元型膠質瘤細胞和新鮮分離的CD11b+ F4/80+巨噬細胞,每三天加入新鮮的巨噬細胞,持續(xù)的刺激后檢測間充質表型的三種主要轉錄因子的表達(EPAS1、CEBPB、FOSL2)。

數據分析方法

1、scRNA-seq數據處理:Seurat,低質量細胞過濾(a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA)、SCTransform標準化、PCA降維(npcs=30)、細胞類群識別FindNeighbors and FindClusters(resolution=0.8)、差異分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25);

2、ST數據處理:Seurat 4.0,SCTransform標準化、 PCA and UMAP降維聚類(npcs=30)、SpatialFeaturePlot空間可視化;

3、腫瘤拷貝數據變異:inferCNV,過濾expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1;

4、細胞軌跡分析:Monocle 2,過濾expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200;

5、轉錄因子活性:SCIENCE,相關性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)

6、細胞通訊:Nichenet(Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test)、CytoTalk(分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes)

研究思路

研究結果

1、scRNA-seq分析GBM腫瘤異質性圖譜

利用Seurat整合分析了來自不同數據集的scRNA-seq數據(GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928),共獲得來自40例患者的54,534個細胞(圖1a);利用inferCNV分析進一步鑒別腫瘤細胞和正常細胞(圖1),與已發(fā)表的WES 數據一致;鑒定注釋到的惡性細胞包括:MES-like細胞(12.2%,CHI3L1、ADM)、AC-like細胞(36%,MLC1、HOPX)、NPC-like細胞(4.9%,CD24、DCX)和OPC-like細胞(26.4%,PDGFRA、OLIG1),非腫瘤細胞包括:巨噬細胞(8.2%,CD163、CD68)、小膠質細胞(1.5%,CX3CR1、TMEM119)、淋巴細胞(0.7%,CD3D、NKG7)、內皮細胞(1.1%,VWF、PECAM1)、腫瘤相關內皮細胞(0.8%,COL1A2、BGN)、少突膠質細胞(4.3%,PTGDS、MBP)(圖1c-d);GBM患者表現出高水平的瘤內異質性,尤其是腫瘤細胞(圖1E-F);GSEA分析也驗證了GBM的不同腫瘤細胞亞型(圖1g)。

圖1 scRNA-seq分析GBM腫瘤異質性圖譜

2、軌跡分析揭示前神經元-間充質亞型轉換中的關鍵轉錄調節(jié)因子

利用細胞軌跡分析,探索GBM不同腫瘤亞型間的分化關系,結果顯示擬時間線上主要由NPC-和OPC-like 腫瘤細胞逐漸分化為AC-和MES-like腫瘤細胞,同時有個小分支為AC-like腫瘤細胞,揭示了GBM的可塑性和前神經元型(proneural, PN)到間質型(mesenchymal, MES)的動態(tài)過渡(圖2a-c);PN與細胞周期、G2M檢查點和神經膠質細胞分化相關的通路顯著富集,表明PN具有高度增殖性和可塑性,而MES與上皮-間充質轉化(EMT)、缺氧、ECM組織和細胞粘附相關的通路顯著富集(圖2d);利用TCGA數據集進行生存分析,結果顯示,與PN組相比,具有MES-like轉錄組特征的患者總生存期較差,而與MES-low組相比,MES-high組預后更差,表明具有間充質特征的GBM患者的生存結局較差(圖2e)。Tips:利用TCGA數據庫中的臨床數據,將單細胞數據中鑒定到關鍵maker基因或基因集進行生存分析,是探討臨床意義的有效途徑。

利用SCENIC分析PN或MES細胞中的關鍵轉錄調控網絡,結果顯示,轉錄因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC細胞中差異過表達,而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC細胞狀態(tài)中差異過表達,細胞軌跡分析證實了PN-MES轉換過程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下調(圖2k)。以上結果突出了從PN到MES細胞狀態(tài)的動態(tài)轉變主要是由關鍵轉錄因子驅動的。

圖2 軌跡分析揭示前神經元-間充質亞型轉換中的關鍵轉錄調節(jié)因子

3、PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析

利用MES基因特征將患者分為MES-high和MES-low組,發(fā)現MES-high組腫瘤微環(huán)境中伴有豐富的巨噬細胞、T細胞和內皮細胞浸潤(圖3a, b);但T細胞浸潤在很多癌種的研究中與患者預后呈正相關,因此利用TCGA數據進一步分析,GBM MES亞型表達更高的T細胞和髓系細胞標志物,并且T細胞與巨噬細胞存在很強的相關性(圖3c-d);對空間scRNA-seq數據進行分析,發(fā)現CD8 + T細胞與CD68 +髓系細胞、內皮細胞共定位(圖3e),證實了T細胞與髓系細胞之間存在空間上的緊密接觸,可能發(fā)生在血管微環(huán)境中(vascular niches)。Tips:每個實驗組增加ST樣本,不僅能與單細胞數據互相驗證,還能對maker基因和細胞類型進行空間定位,精準鎖定有真實空間物理接觸的細胞間互作關系。

利用反卷積算法對TCGA數據進一步進行分析,發(fā)現T細胞豐度與巨噬細胞、樹突狀細胞顯著相關,這是兩個主要的髓系細胞(圖3f);利用流式細胞術,分析小鼠GBM中的免疫細胞,證實了T細胞與CD11b + F480 +腫瘤相關巨噬細胞(TAM)或CD11c + MHCII + DC顯著正相關(圖3g)。因此,間充質亞型中T細胞比例較高主要是由于巨噬細胞的浸潤。

圖3 PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析

4、源自巨噬細胞的GPNMB有助于PN-MES細胞狀態(tài)轉變

利用NicheNet分析腫瘤微環(huán)境中的細胞間信號通訊,鑒定到了多個基質細胞-腫瘤細胞相互調控的配體-受體對,其中預測到巨噬細胞高表達的GPNMB與大多數間充質靶標存在相互作用(圖4a),GPNMB是一種跨膜糖蛋白,最初是在腫瘤細胞中發(fā)現的,參與腫瘤遷移、侵襲、轉移,通過直接抑制T細胞活化來逃避免疫;Tips:基于個性化分析結果,優(yōu)先篩選TOP基因(顯著性、差異倍數、靶標基因數目等),結合研究領域內已有特定功能報道的基因或通路,可以幫助更快鎖定目標分子。

HPA和TCGA數據分析結果顯示,GPNMB主要在巨噬細胞中表達,并且與巨噬細胞標志物顯著正相關,這表明巨噬細胞是GPNMB的主要來源(圖4b, c),流式細胞術結果證實了GPNMB主要在巨噬細胞上表達,而不是樹突狀或腫瘤細胞。Tips:流式細胞術是單細胞測序常見的下游驗證方法,可用來分選目標細胞類群、驗證細胞比例的變化和新鑒定的maker基因作為特定細胞分選的可行性等。

GPNMB在MES亞型患者中高表達,并且與低級別和高級別膠質瘤的預后不良相關(圖4d, e);推測高表達GPNMB的巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞向MES表型轉變,進一步利用細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來驗證這一假設,結果表明,長期接觸巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞中間充質轉錄因子的表達,并且靶向GPNMB的中和抗體治療可以部分消除這種作用,表明GPNMB是PN-MES狀態(tài)過渡的重要調節(jié)因子(圖4f)。

圖4 源自巨噬細胞的GPNMB有助于PN-MES細胞狀態(tài)轉變

5、小鼠scRNA-seq分析單核細胞分化為Gpnmb-high巨噬細胞

收集小鼠GBM scRNA-seq數據,重點關注在早期(d7)和晚期(d28)GBM小鼠的CD45 +免疫細胞。根據細胞maker基因表達鑒定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells(圖5a);與以往的報道類似,巨噬細胞隨著腫瘤進展急劇侵入腫瘤部位,而小膠質細胞在腫瘤發(fā)展過程中逐漸消失(圖5b);細胞軌跡分析推斷出樹突狀細胞和巨噬細胞起源于單核細胞,并隨著腫瘤進展而逐漸分化(圖5c);不同的通路主導了腫瘤浸潤T細胞的募集,單核細胞主要表達Cxcl10、Cxcl9、樹突狀細胞特異性表達Ccl17、Ccl22,而巨噬細胞表達Ccl24,Saa3、Arg1和Gpnmb僅在巨噬細胞中出現(圖5d);在腫瘤發(fā)生過程中,Arg1和Gpnmb的表達在巨噬細胞中被強烈誘導(圖5e-g),這與人GBM數據集中的發(fā)現一致;然而,Gpnmb敲低后CD206(經典M2巨噬細胞標志物)表達不變,提示GPNMB不是M2巨噬細胞極化的驅動因素;免疫熒光染色顯示GPNMB+巨噬細胞與T細胞共定位(圖5h),表明它們之間存在潛在的相互作用。

圖5 小鼠scRNA-seq分析單核細胞分化為Gpnmb-high巨噬細胞

6、GPNMB-high巨噬細胞影響DC激活T細胞

利用CytoTalk算法分析GBM中T細胞與APC-like細胞間的相互作用,研究完整的信號轉導途徑,結果顯示,T細胞通過Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路與單核細胞、Gpnmb-high巨噬細胞、樹突狀細胞相互作用,并且DC細胞與Gpnmb-high巨噬細胞共享Cxcl16-Cxcr6趨化因子信號與T細胞相互作用。為了驗證Gpnmb-high巨噬細胞的調控機制,從GBM腫瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬細胞、D11c + DC和骨髓來源的單核細胞,然后與na?ve T細胞共培養(yǎng)(圖6e);實驗結果顯示,與GPNMB+巨噬細胞和單核細胞相比,CD11c + DC共培養(yǎng)表達更高水平的CD69、IFNγ和GZMB,能更好地誘導T細胞活化(圖6f);T細胞增殖實驗檢測結果也表明,與GPNMB+巨噬細胞和單核細胞相比,CD11c + DC能顯著促進T細胞增殖(圖6g)。綜合以上結果,確定了關鍵的GPNMB-high巨噬細胞亞群是GBM細胞間通訊的樞紐,不僅誘導PN-MES腫瘤細胞轉化,而且通過與DC競爭而損害T細胞激活。Tips:利用細胞通訊分析篩選潛在細胞間互作的受體-配體對,結合細胞共培養(yǎng)、co-IP和免疫熒光等實驗,可以探究目標細胞類型對特定細胞功能的影響及機制。

圖6 GPNMB-high巨噬細胞影響DC激活T細胞

研究總結

1、本文通過scRNA-seq數據將高度異質性的GBM腫瘤細胞分為MES-like、AC-like,OPC-like和NPC-like亞型;

2、利用細胞軌跡分析和轉錄調控網絡分析預測到由特定TF調節(jié)的PN到MES細胞狀態(tài)轉換;

3、利用空間轉錄組數據、TCGA數據庫、細胞通訊分析,鎖定到了關鍵的GPNMB-high巨噬細胞,在PN-MES細胞狀態(tài)轉變中發(fā)揮重要作用;

4、通過信號轉導分析和細胞共培養(yǎng)研究,進一步揭示了這些源自單核細胞的GPNMB高巨噬細胞亞群可能無效地保留T細胞不被樹突狀細胞激活,提示未來靶向GPNMB-high巨噬細胞的聯(lián)合免疫治療可作為有潛力的治療策略。

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參考文獻

Xiong A, Zhang J, Chen Y, Zhang Y, Yang F. Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM. EBioMedicine. 2022;83:104239. doi:10.1016/j.ebiom.2022.104239

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