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 分類: 時(shí)空組學(xué), 智能制造

單細(xì)胞測(cè)序中,從樣本制備到文庫(kù)測(cè)序要經(jīng)過(guò)5個(gè)技術(shù)流程:?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備、單細(xì)胞精準(zhǔn)捕獲&cDNA擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、以及數(shù)據(jù)分析步驟。上期分享了單細(xì)胞測(cè)序1丨單細(xì)胞懸浮液制備,主要介紹了從動(dòng)物組織、血液、植物組織三種樣本中獲取單細(xì)胞懸浮液的基本方法和注意事項(xiàng)。接下來(lái)分享:如何精準(zhǔn)捕獲單細(xì)胞&cDNA擴(kuò)增等。

目前常見的捕獲單細(xì)胞技術(shù)方法有:微流控和微孔板法。本文通過(guò)基于微流控法的平臺(tái)-百創(chuàng)DG1000來(lái)精準(zhǔn)捕獲細(xì)胞,并進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄、cDNA合成與擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn),從而獲得每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。

1、芯片加樣

處理好的細(xì)胞懸液盡量在30min以內(nèi)上機(jī)實(shí)驗(yàn),長(zhǎng)時(shí)間放置,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。按照一定的加樣順序,分別將細(xì)胞相、膠珠相(DG1000-3′ gel beads)、油相加入到芯片(圖1:左圖)對(duì)應(yīng)孔中,然后將芯片放入到百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀中(圖1:右圖),啟動(dòng)開關(guān)。

圖1:百創(chuàng)C1000芯片結(jié)構(gòu)(左圖);百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀(右圖)

圖1:百創(chuàng)C1000芯片結(jié)構(gòu)(左圖);百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀(右圖)

2、形成GEMs

儀器運(yùn)行后,通過(guò)控制流速的方法,使得在“Y型”接口處,一個(gè)膠珠會(huì)吸附單個(gè)細(xì)胞及逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液一起向右流動(dòng)。到了“十字”接口處,它們與油相接觸后,每一個(gè)油滴中會(huì)包裹著一個(gè)膠珠與一個(gè)細(xì)胞,也就是“油包水”(GEMs)結(jié)構(gòu)。

圖2:形成“油包水”的原理(左);“油包水”(GEMs)結(jié)構(gòu)示意圖(右)。

圖2:形成“油包水”的原理(左);“油包水”(GEMs)結(jié)構(gòu)示意圖(右)。

引物結(jié)構(gòu)

  • 百創(chuàng)DG1000-3′ gel beads(膠珠)上固定的引物由4部分組成 :Read1、Cell Barcode、UMI、Poly(dT)VN。
  • Read 1: 是一段已知的短核昔酸序列,主要用于后續(xù)的上機(jī)測(cè)序
  • Cell Barcode:片段長(zhǎng)度54bp,種類約為88萬(wàn)種,一個(gè)膠珠對(duì)應(yīng)于一個(gè)特異Cell Barcode序列。
  • UMI:在 mRNA反轉(zhuǎn)錄后,每一個(gè)mRNA隨機(jī)連上一個(gè)UMI,可以通過(guò)計(jì)數(shù)不同的UMI,最終確定mRNA的數(shù)量。
  • Polv(dT)VN:與mRNA3’端的poly(A)結(jié)合,進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
圖3:引物結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3:引物結(jié)構(gòu)示意圖。

3、cDNA生成與擴(kuò)增

GEMs形成后,細(xì)胞裂解釋放出mRNA;同時(shí)膠珠也會(huì)自動(dòng)溶解,釋放出大量含有Barcode序列的引物,并利用引物末端的Ploy(dT)VN序列捕獲液滴中的mRNA,并在一個(gè)個(gè)GEM中獨(dú)立完成mRNA逆轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA。隨后“油包水”結(jié)構(gòu)裂開,進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。

將擴(kuò)增得到的cDNA純化后,可用于后續(xù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。由于每一個(gè)單細(xì)胞的cDNA文庫(kù)標(biāo)記上了細(xì)胞條形碼(Barcode)。測(cè)序時(shí),就把攜帶相同Barcode的序列視為來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞,達(dá)到區(qū)分細(xì)胞的目的。

以上就是生成GEMs、mRNA逆轉(zhuǎn)錄、以及cDNA合成與擴(kuò)增的全部?jī)?nèi)容。下期會(huì)具體介紹數(shù)據(jù)分析指標(biāo)的意義。

單細(xì)胞平臺(tái)-百創(chuàng)DG1000

百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標(biāo)記等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞精準(zhǔn)捕獲。除了儀器以外,百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨(dú)立芯片及配套試劑盒。

百創(chuàng)DG1000部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

人PBMC

人PBMC

大鼠PBMC

大鼠PBMC

雞PBMC

雞PBMC

鱉PBMC

鱉PBMC

黃顙魚PBMC

黃顙魚PBMC

牡蠣PBMC

牡蠣PBMC

小鼠胚胎

小鼠胚胎

某魚類食道

某魚類食道

某植物細(xì)胞核

某植物細(xì)胞核

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