2023年2月21日，中國農業(yè)大學秦峰教授團隊在Nature Genetics在線發(fā)表了題為“Genome assembly and genetic dissection of a prominent drought-resistant maize germplasm” 的研究論文。報告了玉米抗旱優(yōu)良種質基因組CIMBL55組裝和注釋結果，揭示其優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎。中國農業(yè)大學秦峰課題組博士后田甜和博士生王書會為論文共同第一作者，中國農業(yè)大學秦峰教授為通訊作者。百邁客完成了PacBio、Hi-C測序及相關分析工作。

研究背景

干旱是制約作物生產的主要逆境因素之一，由于全球氣候變化，自然災害頻發(fā)，極端天氣難以預測，培育高產、抗逆的作物品種的需求比以往任何時候都更加迫切。玉米(Zea mays)在世界各地廣泛種植，是一種具有巨大現(xiàn)代經濟重要性的植物，可作為食品和替代能源。然而玉米特別容易受干旱的影響，據估計，世界上只有約不到5%的玉米種質資源在美國的育種項目中得到利用，表明玉米中存在著多種多樣的遺傳資源，可能是培育抗旱品種的優(yōu)良來源。

目前，還未有優(yōu)良抗旱玉米種質基因組被破譯，鑒定玉米抗旱種質資源，對進一步解析玉米抗旱性的遺傳基礎提供依據，對玉米抗旱性的遺傳改良具有重要意義。

材料方法

基因組：60×RSII、100×Sequel?2、160×BioNano、35×Hi-C

遺傳變異研究：CIMBL55、25個NAM Founder?lines、SK、Mo17、K0326和A188基因組間變異研究

甲基化：CIMBL55、B73和Mo17全基因組亞硫酸氫鹽測序(BS-seq)

研究內容

CIMBL55基因組的組裝與注釋

CIMBL55與B73玉米基因組的基因共線分析

玉米基因組間遺傳變異對抗旱性的影響

表觀遺傳變異對玉米抗旱性的影響

ZmRtn16基因對玉米抗旱性的影響

主要研究結果

1.CIMBL55基因組的組裝與注釋

熱帶/亞熱帶（TST）玉米種質CIMBL55具有顯著的抗旱性，在干旱脅迫條件下，與B73和Mo17相比，CIMBL55的苗期存活率高，產量損失?。▓D1a-d）。本研究結合PacBio、Illumina、Hi-C和BioNano光學圖譜等技術對其進行基因組組裝，最終組裝基因組大小為2,159.5Mb，contig?N50為14.3Mb，scaffold?N50為223.6Mb，隨后，通過Hi-C技術將scaffold掛載至10條染色體上（圖1e）。BUSCO分析表明，~98%的基因是完整存在的。隨機挑選9個BAC序列與基因組組裝比對表明，兩者具有很好的序列同源性。這些結果表明CIMBL55基因組具有高度完整性和準確性。CIMBL55、B73、Mo17和SK（另一種TST種質）基因組共線性分析發(fā)現(xiàn)，在B73和CIMBL55間存在大的易位、重復和倒位事件；與B73和Mo17相比，CIMBL55和SK在Chr7上有~440 kb的缺失，在Chr8上有~560 kb的插入，表明這些差異可能在TST種質中普遍存在。

基于從頭預測和同源比對預測對CIMBL55基因組的重復區(qū)域進行注釋，發(fā)現(xiàn)83.95%的基因組序列為轉座子元件?；趶念^預測、同源比對預測和轉錄組輔助預測在CIMBL55中共注釋了38,439個基因，平均基因長度為4,289 bp。Circos圖顯示跨越染色體臂的DNA-TEs和蛋白編碼基因的分布模式相似，RNA-TEs的分布與著絲粒較高的CG和CHG甲基化有關。

2. CIMBL55與B73玉米基因組的基因共線分析

基因共線性反映了不同基因組間的基因含量及其在染色體上的排列。CIMBL55與B73基因組之間的共線基因分析表明，73%的CIMBL55基因位于共線基因塊，27%的基因是非共線基因。共線基因進一步可以分為三類。1類基因(42%)位于B73和CIMBL55的同源染色體上，多數(shù)為單拷貝基因(one-one syntenic)。2類基因(29%)是位于各自基因組中兩條不同同源染色體上的重復基因(multi–multi synteny)（圖2b）。3類基因(2%)位于CIMBL55當前組裝中未定位到染色體上的contigs中，但與B73中的相應基因處于共線性塊中。非共線基因包括class 4(16%)和class 5(11%)2類基因。

RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，共線基因比非共線基因具有更高的轉錄豐度，表明基因組重排可能影響了基因的表達（圖2d）。玉米祖先經歷了全基因組復制事件，然后是偏分鎦和二倍化。參考高粱基因組，構建了CIMBL55的亞基因組，發(fā)現(xiàn)其偏分鎦與B73一致，支持了玉米進化過程的保守性。在CIMBL55的兩個亞基因組中，有61.5%的2類基因為成對保留的，表明2類基因在玉米進化過程中保持相對保守。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在多種脅迫的應激反應中顯著富集。進一步對與ABA信號和干旱響應相關基因家族分析發(fā)現(xiàn)，72%的基因屬于2類基因，顯著高于全基因組水平上的2類基因（29%）。這些結果表明，在玉米進化過程中，參與環(huán)境響應和適應的基因傾向于成對保留。

3.遺傳變異對抗旱性的影響

為了確定CIMBL55抗旱性的遺傳機理，本研究在泛基因組水平上研究了25個NAM建立系和另外4個玉米品系SK、Mo17、K0326、A188的遺傳變異。共得到17,581,014個結構變異(SVs)（圖3a）。為了更深入地了解CIMBL55的基因組變異，以CIMBL55為參考，在B73和Mo17中鑒定到841,911個DNA變異(>20 bp)。隨后，在368份玉米自然群體中，成功對544,853個SVs進行了基因型鑒定，并基于干旱后的幼苗存活率對其耐旱性進行了分析。

此前研究中，基于全基因組關聯(lián)分析(GWAS)和孟德爾隨機化分析分別鑒定了42個和97個抗旱性候選基因。作者在CIMBL55基因組中對這些位點的基因型進行研究，鑒定得到108個抗旱基因。值得注意的是，在CIMBL55中發(fā)現(xiàn)了65個基因的優(yōu)異單倍型，解釋了CIMBL55優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎。此外，在108個基因中，有11個候選基因在非CIMBL55等位基因中被鑒定為優(yōu)勢單倍型，這表明其他種質可能含有與CIMBL55互補的玉米抗旱性遺傳資源（圖3b）。

研究發(fā)現(xiàn)，位于ZmABF4基因第二內含子的SNP (S1474)和SV (S3205, 42 bp)與該基因的表達和苗期抗旱性密切相關。ZmABF4編碼bZIP轉錄因子，為ABA和干旱誘導表達的主要調節(jié)因子。攜帶ZmABF4^CIMBL55等位基因的種質在基因表達和抗旱性方面明顯高于攜帶ZmABF4^B73等位基因的種質（圖3d, e）。轉基因過表達分析發(fā)現(xiàn)，與野生型(WT)相比，ZmABF4轉基因株系在干旱脅迫下存活率顯著提高，葉片失水率降低（圖3f-h）。說明ZmABF4對玉米抗旱性具有正向調控作用，?ZmABF4^CIMBL55可能是玉米抗旱性的優(yōu)異等位基因。

4.表觀遺傳變異對抗旱性的影響

對B73、Mo17和CIMBL55三個材料進行全基因組亞硫酸氫鹽測序(BS-seq)，準確評估其基因組的DNA甲基化狀態(tài)。mCG和mCHG的甲基化水平在全基因組中較高，但在基因邊界處明顯下降。相比之下，包括RNA-TE區(qū)域在內的基因組中mCHH水平普遍較低，而DNA-TE元件中mCHH水平較高，表明在這兩種類型的TEs中，CHH甲基化的調控機制不同。

基于CIMBL55和B73基因組序列，鑒定SV相關基因組區(qū)域的差異DNA甲基化。在CIMBL55中鑒定到5,346個插入序列用于SV相關DNA甲基化分析。根據mCG、mCHG和mCHH的水平，將插入序列的DNA甲基化模式聚類為5組（圖4a-c）。其中cluster?4插入片段的mCG、mCHG和mCHH水平明顯高于側翼序列（圖4b, c）。并且鄰近基因的轉錄起始位點的插入序列具有顯著高的CHH甲基化水平，富集了大量的DTH (DNA Transposon terminal inverted repeat Harbinger)類轉座子（圖4b）。

在ZmNAC075的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了差異DNA甲基化。CIMBL55和B73的基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，在ZmNAC075^B73的上游區(qū)域有兩個插入序列，具有較高的甲基化狀態(tài)。此外，攜帶ZmNAC075^B73等位基因的種質在干旱脅迫下的基因表達水平和幼苗存活率明顯低于攜帶ZmNAC075^CIMBL55等位基因的種質（圖4e,f）。CRISPR靶向基因敲除結合全基因組BS-seq分析顯示，發(fā)現(xiàn)兩個插入序列的CHH高甲基化狀態(tài)可能抑制基因表達進而影響抗旱性（圖4l）。

5.ZmRtn16可以顯著提高玉米的抗旱性

另外，基因組結構變異分析發(fā)現(xiàn)CIMBL55中ZmRtn16的3′-UTR區(qū)域缺少一個28bp的插入序列，該變異與干旱脅迫后的幼苗存活率密切相關（圖5d）。表型分析發(fā)現(xiàn)，該變異影響基因表達和抗旱性（圖5e, f）。分別從B73和CIMBL55中克隆了3’-UTR序列（包含一個先前確定的顯著SNP和28 bp的SV）。分析發(fā)現(xiàn)28 bp的插入有利于增強ZmRtn16的表達豐度，而SNP對其沒有影響。

進一步構建ZmRtn16過表達轉基因株系，發(fā)現(xiàn)其比WT具有更好的抗旱性（圖5h）。而兩個CRISPR基因敲除株系中抗旱性較差（圖5i）。過表達株系葉片失水率較低，葉片氣孔?。欢鳮O株系葉片失水率較高，葉片氣孔更大（圖5h-i）；表明過表達株系的抗旱性與氣孔大小相關。比較ZmRtn16-OE、zmrtn16-crispr和WT株系的表型，發(fā)現(xiàn)在干旱條件下，ZmRtn16-OE的抗旱性更好（圖5j）。以上結果表明ZmRtn16在植物抗旱性中發(fā)揮了積極作用。

為了解ZmRtn16的生物學功能，亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)ER標志物與ZmRtn16-GFP融合蛋白共定位在ER中，表明ZmRtn16-GFP在ER中發(fā)揮作用。免疫共沉淀(co-IP)顯示ZmRtn16能與液泡膜H⁺-ATPase復合體A (ZmVHA-A)和E3亞基?(ZmVHA-E3)相互作用。隨后，通過比較zmrtn16-crispr和WT株系的ZmVHA-A和ZmVHA-E3亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)ZmRtn16可以促進ZmVHA-A和ZmVHA-E3的液泡膜定位（圖6c）。此外，與WT植物相比，ZmRtn16-OE株系液泡質子泵活性較高，而ZmRtn16-KO株系液泡質子泵活性較低（圖6e），突出了液泡質子泵在抗旱性上的作用。綜上所述， CIMBL55基因組中ZmRtn16基因3′ -UTR中28 bp缺失，可能增強ZmRtn16的表達，促進了ZmVHA-A和ZmVHA-E3在液泡膜中的定位，從而提高玉米的抗旱性。

總結

本研究構建了一個高質量的抗旱玉米種質CIMBL55的基因組。結合已發(fā)表的30個玉米自交系基因組在泛基因組水平上進行遺傳變異分析，在108個先前鑒定的抗旱基因中，CIMBL55中至少攜帶了65個優(yōu)異等位變異，這可能是構成CIMBL55優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎。值得注意的是，編碼一種網狀樣蛋白（reticulon-like protein）的ZmRtn16通過促進液泡H⁺– ATPase活性來增強抗旱性，突出了液泡質子泵在玉米抗旱性中的作用?？傊?，?CIMBL55基因組的組裝為玉米抗旱性的遺傳解析和改良提供了基礎，為我國和全球的糧食安全提供了支持。