miRNA是一類內(nèi)源性小RNA，長(zhǎng)度為18-40nt，不編碼蛋白。在植物中以降解mRNA或阻止mRNA翻譯的方式起到重要作用。大多數(shù)已知的miRNA都會(huì)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，已經(jīng)在擬南芥、楊樹等植物中鑒定到了一類響應(yīng)冷刺激的miRNA。大豆是一類重要的糧食作物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)成分。然而，冷脅迫會(huì)直接影響大豆的生長(zhǎng)發(fā)育并導(dǎo)致產(chǎn)量的減少。今天小R就為大家分享一篇研究大豆冷脅迫下miRNA及其靶基因的作用機(jī)制的文章。

實(shí)驗(yàn)材料

大豆“Taiwan 75”培養(yǎng)在正常條件下，第一真葉期的幼苗分為對(duì)照組和處理組。對(duì)照組—25°C（12h），17°C（12h），處理組—4°C（24h）。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

研究結(jié)果

1.sRNA測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
首先，對(duì)大豆4°C處理組（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及對(duì)照組進(jìn)行相對(duì)生長(zhǎng)速率（RGR）和MDA含量的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)，對(duì)照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此，選擇冷脅迫24h進(jìn)行sRNA測(cè)序。

對(duì)照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長(zhǎng)度為21nt所占比例*高（圖1A）。非冗余的reads，長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)可以看出24nt所占比例*高，在對(duì)照組和處理組中分別為68.4%和59%（圖1B）。

圖1.sRNA長(zhǎng)度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個(gè)miRNA，屬于133個(gè)家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發(fā)育過程和響應(yīng)脅迫上起到重要作用。通過同源比對(duì)鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進(jìn)化。

 

3.預(yù)測(cè)大豆中新的miRNA
根據(jù)miRNAs前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)來預(yù)測(cè)miRNAs，找到3個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA并鑒定折疊成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

 

4.驗(yàn)證大豆中預(yù)測(cè)的miRNA
為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，利用qRT-PCR分析miRNA表達(dá)情況。選擇了35個(gè)miRNA（33個(gè)已知miRNA，2個(gè)預(yù)測(cè)miRNA）進(jìn)行qRT-PCR分析。線性回歸分析測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果相關(guān)性系數(shù)為0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果在√確的倍數(shù)方面有些差異，這可能是由于2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果敏感性和特異性的不同導(dǎo)致的，但是miRNA表達(dá)趨勢(shì)是一致的。

圖2.qRT-PCR結(jié)果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測(cè)序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads，2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個(gè)轉(zhuǎn)錄本是54個(gè)miRNA家族的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以降解2個(gè)甚至更多的靶基因，與之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個(gè)基因，脫落酸響應(yīng)結(jié)合因素蛋白家族和2個(gè)基因，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子等。而且，有7個(gè)轉(zhuǎn)錄本受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控。

 

6.鑒定大豆冷脅迫下相關(guān)的miRNA
對(duì)miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，共鑒定到32個(gè)miRNA家族的51個(gè)miRNA差異表達(dá)。在冷脅迫下有30個(gè)下調(diào)表達(dá)，21個(gè)上調(diào)表達(dá)。

對(duì)相應(yīng)靶基因進(jìn)行功能注釋來研究差異表達(dá)的miRNA可能行使的功能。差異表達(dá)的miRNA可以分為四類。第一類包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，參與調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)。第二類包括miR4411，其對(duì)應(yīng)靶基因涉及抵御疾病。第三類包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其對(duì)應(yīng)靶基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育中的適應(yīng)性。為了進(jìn)一步確認(rèn)冷脅迫下miRNA和靶基因的關(guān)系，選擇了5個(gè)miRNAs及其靶基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，在冷脅迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上調(diào)。相反的，他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著下調(diào)。說明miRNA和對(duì)應(yīng)靶基因呈負(fù)相關(guān)性。

圖3.miRNA和對(duì)應(yīng)靶基因qRT-PCR圖

 

為了近一步確認(rèn)這些差異表達(dá)miRNA的功能，對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析。靶基因共參與了56個(gè)分子功能terms，37個(gè)生物學(xué)過程terms和7個(gè)細(xì)胞組分terms。在分子功能分類下，ATP結(jié)合、蛋白結(jié)合、組蛋白結(jié)合等terms是顯著富集的。超過35%miRNAs的靶基因參與了生物學(xué)過程途徑。

 

圖4.GO注釋

結(jié) 論
首次研究大豆冷脅迫下miRNA調(diào)控基因表達(dá)情況。利用降解組測(cè)序鑒定到了上百個(gè)靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互關(guān)系。盡管miRNAs調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，目前還不是十分清楚，本次研究完善了miRNA數(shù)據(jù)庫，為研究大豆和其他物種的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要基礎(chǔ)。也發(fā)現(xiàn)了51個(gè)響應(yīng)冷脅迫的miRNAs。

文章亮點(diǎn)
1.處理時(shí)間點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置多個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行處理并進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，最終選擇變化較為明顯的時(shí)期。選樣時(shí)間點(diǎn)有理有據(jù)。
2.利用降解組測(cè)序z確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻(xiàn)
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.