12篇QTL定位相關(guān)的SCI文章“橫空出世”了～～～

在這里，小編必須要恭賀各位老師們在新年伊始取得了“開門紅！

來來來，咱往下看↓
（文末繼續(xù)有中標的國自然標書分享~）

本期，為大家解讀通過SLAF-BSA對小麥抗病性進行基因定位的文章，一起來看一下長江大學馬東方副教授和朱永興講師在《Scientific Reports》上發(fā)表的“利用SLAF-BSA快速鑒定小麥空間輻射突變體中抗條紋病基因”。

1.研究背景

普通小麥是主要的糧食作物之一，但由于小麥條銹病菌的侵害，使得小麥產(chǎn)量逐年降低，尤其是在西南和西北地區(qū)。條銹病抗性分為全生育期抗性（ASR，包括幼苗和成株）和成株抗性（APR），前者通常是單個主效基因控制的，是傾向于針對某一特定菌種而產(chǎn)生的抗性，而后者的抗性則不針對某一特定菌種且為數(shù)量遺傳，其保護水平通常是不完全的，并受生長階段，溫度，濕度和接種量的影響。因此，定位這兩種小麥抗條銹病抗性基因是當務(wù)之急。

2.材料與方法

01.材料
親本：銘賢169（Mingxian 169）×R39，銘賢169為感病栽培種；R39為抗性品種，是鄭麥9023（zhengmai 9023）突變體材料自交8代所形成
群體類型：F2群體
混池規(guī)模：45+45
其他材料：F1、BC1和鄭麥9023

02.實驗處理
在可溫控的溫室內(nèi)，利用7個條銹病菌 (CYR29, CYR30, CYR31, CYR32, CYR33, Su11-4 和 Su11-11)的新鮮夏孢子對雙親、F1、BC1，F(xiàn)2和鄭麥9023的完全展開的第一片子葉進行侵染。
幼苗試驗處理：先在10°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)24h，然后移置溫室，在環(huán)境變化的條件下培養(yǎng)（循環(huán)方式：18°C下，光照16h；10°C下，黑暗8h）；
成株試驗處理；將發(fā)芽幼苗在4℃冰箱中春化5周，然后移栽到盆中溫室生長。
1個月后，孕穗期的親本和后代接種混合有滑石的夏孢子（urediniospore）并如上所述溫育，接種18-20d記錄侵染類型（IT），并按前人劃分標準分為0-4。IT 0至2+的認為具有抗性，而IT3至4的則認為是易感的。
收集種子測量千粒重（TSW）。每個栽培品種三個生物學重復(fù)。

03.技術(shù)手段
1）SLAF-seq+BSA：銘賢169、R39、感病混池和抗病混池（混池材料各45個），計算方法：SNP-index和ED；
2）SSR-遺傳圖譜：銘賢169、R39、高感病混池和高抗病混池（混池材料各10個，來自上述測過序的材料）（互為驗證）；
3）qRT-PCR：每次實驗做了三個生物學重復(fù)，每個重復(fù)兩次技術(shù)性重復(fù)。

3.實驗結(jié)果

01.小麥突變體R39具有成株抗性
在抗性鑒定中發(fā)現(xiàn)，其在幼苗期對7種病菌均呈現(xiàn)感病，而成株期均呈現(xiàn)抗病（圖1a）；而鄭麥9023和銘賢169全生育期均為感病。此外，R39的千粒重顯著高于鄭麥9023和銘賢169，這表明在條銹病發(fā)病條件下，R39的籽粒產(chǎn)量更高，種子質(zhì)量更好（圖1b-d）。

圖1 抗性和產(chǎn)量評價

02.針對CYR33菌種，R39 的APR由一個隱性基因控制
如表1，F(xiàn)2群體分離比是3:1，所以CYR33的R39 的APR由一個隱性基因控制。這個抗病基因命名為YrR39。在R39、抗性F2和抗性BC1材料中一個顯著特征是葉斑點。而且上述兩個特征在未接種的群體內(nèi)也是一樣的。

表1 親本及分離群體抗病和感病頻率統(tǒng)計

03.SLAF-seq+BSA的分析結(jié)果
利用SNP-index和ED兩種算法，將抗病基因YrR39定位在4B染色體上17.39 Mb的區(qū)域內(nèi)。（這里就不細說了，直接上圖）

圖2 BSA分析的兩種方法的結(jié)果

04.利用SSR標記驗證目標區(qū)域
4B染色體上有83對SSR是有多態(tài)性的，但是其中只有8對能清楚的區(qū)分雙親及兩個混池。利用其對462個F2個體進行基因分型并構(gòu)建遺傳圖譜，將YrR39定位于染色體4BL 的2.6cM的區(qū)間內(nèi)，其側(cè)翼標記為Xwmc495和Xwmc48（如圖3）。這與BSA分析結(jié)果一致，也驗證了SLAF-seq檢測結(jié)果的準確性。

圖3? 染色體4BL的連鎖圖譜

05.條銹菌感染對候選基因表達的影響
目標區(qū)域包含126個基因（表3），通過功能注釋，找到21個與條銹病抗性相關(guān)的基因，擬定為候選基因，并進行qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，在病菌接種后12、24、48和96h，只有候選基因Traes_4BS_C868349E1（注釋為F-box / LRR-重復(fù)蛋白）在R39中顯示出比在銘賢169中更高的表達水平（圖4）。 這表明其可能參與了R39對條銹病的抗性。

表3 關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)結(jié)果

圖4? 21個候選基因的qRT-PCR結(jié)果

借鑒之處

1. 表型鑒定的方法是基于前人的方法，且將突變的原始材料鄭麥9023作為對照，增加結(jié)果的可靠性；
2. 利用SSR圖譜和測序結(jié)果互相驗證，確保結(jié)果可靠；
3. 找到區(qū)間，然后看功能注釋找候選基因，對候選基因進行qRT-PCR驗證（也可用RNA-seq來驗證）
4. 研究斑點性狀這個病癥與抗性的關(guān)系，這一點來源于細心的觀察和不斷的思考（思考什么呢？你懂得~~）；
5. 作者仍在繼續(xù)驗證這個基因（科研的態(tài)度）。正所謂真金不怕火煉，前面所提幾種方法均可對其驗證，以增加可靠度。

遺傳群體事業(yè)部 小猴子丨文案
許語輝 | 審核
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