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 分類: 群體遺傳

草莓枝葉和果實的顏色是由于液泡中的花青素積累形成的,但影響花青素積累的基因調控機制研究較少。近日,Journal of Experimental Botany在線發(fā)表了百邁客與華中農業(yè)大學園藝植物生物學教育部重點實驗室康春穎教授的合作文章,該研究以BSA混池測序的方法為基礎對野生草莓種突變體進行分析,成功克隆到影響葉片和果實著色的RAP基因并對其功能進行驗證,下面圖譜君就為您帶來該文章的解讀。

文章題目:RAP codes for a GST anthocyanin transporter that is essential for the foliage and fruit coloration in strawberry

合作單位:華中農業(yè)大學

雜志:Journal of Experimental Botany

 

基因定位材料與方法

材料:

親本YW5AF7(野生型)和rap(ENU突變體)

F2群體,27(野生表型)+18(突變表型)混池;

測序平臺:Illumina HiSeq X Ten

關聯(lián)方法:SNP index

驗證方法:PCR擴增 + Sanger測序

 

結果分析

1. 表型鑒定

作者利用ENU誘變產生了綠色葉柄和葉片的突變體rap,相較與野生型YW5AF7,rap表皮細胞的色素沉著大大減少,葉柄的橫截面脈管系統(tǒng)周圍皮層細胞中顯示出相同的變化,且與色素減少表型相一致的是rap葉片葉柄中總花青素含量顯著降低(P <0.01),rap和YW5AF7對照果實中花青素含量都極低(圖1)。通過對已知花青素合成途徑相關基因表達及測序分析,RAP為一新基因參與花青素的積累,調控草莓的生長發(fā)育。

圖1 表型鑒定

2. 基因定位

利用rap與YW5AF7雜交產生F2群體,突變體與野生型植物的比例接近1:3,說明rap由隱性單位點控制。應用BSA方法,將F2群體18株突變表型及27株野生表型植株植物全基因組重測序,在突變體和野生混池中分別獲得43.3M和48.5M reads。共找到64個SNP位點與表型相關聯(lián)。其中,在基因間區(qū)域有41個,內含子有11個,UTR有3個,編碼序列有9個。作者重點關注了9個編碼區(qū)的SNP差異(圖2),其中8個位點導致同義突變或錯義突變,僅一個SNP(C到T)導致基因31672的提前終止,通過PCR擴增和Sanger測序在50個F2 rap突變體中單獨檢測該SNP,所有個體都均表現(xiàn)出純合突變。此外,RAP的表達水平在rap葉柄中大大降低,將gene31672確定為RAP主要的候選基因。

圖2 突變位點及表達量檢測

3. RAP 功能研究

RAP 編碼谷胱甘肽S-轉移酶(GST),F(xiàn). vesca中有的7個GST同源基因,它們被命名為RAP-L1到RAP-L7,qRT-PCR表達量分析表明,RAP主要在果實中表達較高。為了探索它們對果實著色的貢獻,分別在果實成熟的過程的4個發(fā)育階段檢測RAP與其它同源基因的表達趨勢,RAP-L4在綠色階段是表達最豐富,RAP從著色階段開始表達,且表達量較高(圖3)。

圖3 表達量檢測

以上結果表明RAP相比與其它同源基因,在草莓著色發(fā)育階段發(fā)揮更重要的作用,構建35S::RAP-RFP 載體轉化rap 同源突變體tt19-7,可以互補tt19-7表型,RAP-RNAi 轉化材料和對照相比,花青素含量降低,研究發(fā)現(xiàn)RAP位于果實特異轉錄因子FvMYB10的下游發(fā)揮作用,調控果實顏色。

總結

本文應用F2群體中27+18的混池BSA分析,通過對候選區(qū)段SNP注釋分析,成功克隆到RAP基因,它編碼谷胱甘肽S-轉移酶,參與草莓葉柄及果實花青素的積累,調控葉色及果色形成,后期可用于草莓果色輔助性育種。

 

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