組織再生需要細(xì)胞根據(jù)其所在空間位置調(diào)控自我更新和分化。位置記憶能使具有再生能力的細(xì)胞從未受傷的組織獲得空間信息。目前，科學(xué)家們認(rèn)為位置記憶是依賴(lài)于某些信號(hào)分子的梯度，但有關(guān)它們的信息卻很少被揭示。在這篇文章中，作者以成年斑馬魚(yú)魚(yú)尾為研究模型，并沿著空間軸（近端，中部，遠(yuǎn)端）對(duì)未受傷魚(yú)尾的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組以及造模后魚(yú)尾的蛋白組進(jìn)行了定量分析。

 

材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)材料：
(1)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：
對(duì)沿尾鰭近遠(yuǎn)中軸三個(gè)位置的每個(gè)位置進(jìn)行RNA-seq；近端，中間和遠(yuǎn)端，每個(gè)樣本5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總計(jì)15個(gè)樣本。
(2)蛋白組測(cè)序：
實(shí)施了三次獨(dú)立的生物實(shí)驗(yàn)以量化在未損傷鰭中沿近軸軸線(xiàn)的蛋白質(zhì)表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)1：收集并匯集來(lái)自八只年齡匹配的魚(yú)的近端和遠(yuǎn)端區(qū)域。
實(shí)驗(yàn)2：收集并匯集來(lái)自20只年齡和性別匹配的魚(yú)的背腹和腹側(cè) – 遠(yuǎn)側(cè)區(qū)域。
實(shí)驗(yàn)3：收集并匯集了來(lái)自20只年齡匹配和性別匹配的魚(yú)的近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域。中間區(qū)域僅在實(shí)驗(yàn)3中被采樣。
(3)代謝組測(cè)序：
分別收獲近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域來(lái)自六只成年魚(yú)（三只雄性和三只雌性）。
2、實(shí)驗(yàn)方法：Illumina 測(cè)序；LC-MS；Label Free
3、研究策略：轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組

研究結(jié)果

????????為了鑒定可能參與尾鰭位置記憶的候選分子，本研究對(duì)未受傷的斑馬魚(yú)尾鰭的近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA-seq)和無(wú)標(biāo)記定量(LFQ)蛋白質(zhì)組學(xué)(圖1A)，共鑒定出566個(gè)轉(zhuǎn)錄本和238個(gè)蛋白質(zhì)，主要存在于近或遠(yuǎn)的富集梯度中(圖1B)。另外，主成分分析(PCA)顯示鰭的近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間的轉(zhuǎn)錄物(圖1C)和蛋白質(zhì)(圖1D)豐度的變化很大。中間區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本聚集成一個(gè)獨(dú)特的組，但更接近于遠(yuǎn)端區(qū)域(圖1C)。差異豐富分子的最大差異發(fā)生在近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間，包括1,424個(gè)轉(zhuǎn)錄本和113個(gè)蛋白質(zhì)(圖1E)。因此，基因組的表達(dá)在整個(gè)尾鰭的近遠(yuǎn)端軸上存在著定量的差異。

Fig.1. Transcriptomic and proteomic mapping of positional information in uninjured caudal fins.

圖1 無(wú)損傷尾鰭位置信息的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

        為了確定沿尾鰭近遠(yuǎn)端軸線(xiàn)差異表達(dá)的分子類(lèi)型，因此對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO分析(圖2A)。轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞識(shí)別的主要監(jiān)管者，因此是位置記憶效應(yīng)物的最佳候選者。在作者的RNA-seq數(shù)據(jù)中編碼轉(zhuǎn)錄因子的693個(gè)mRNA中，有53個(gè)在尾鰭前緣和末端區(qū)域差異表達(dá)(圖2B)。對(duì)應(yīng)于964個(gè)跨膜受體中的80個(gè)和222個(gè)離子通道蛋白中的55個(gè)的RNAs在近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間差異表達(dá)。這些命中包括谷氨酸和多巴胺可吸收G蛋白偶聯(lián)受體和幾個(gè)Ca2+和K+可滲透通道(圖2C和D)。此外，作者發(fā)現(xiàn)與先前不涉及生長(zhǎng)控制或再生的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的跨膜蛋白的差異表達(dá)，如ephrin和ednrab。RA，WNT和FGF信號(hào)傳導(dǎo)等幾種途徑在附肢發(fā)育和再生期間已知在生長(zhǎng)控制和圖案化中的作用，這些信號(hào)通路分別包含55，52和41個(gè)基因，并確定了12個(gè)RA，13個(gè)WNT和10個(gè)FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因相反的轉(zhuǎn)錄梯度(圖2E-G)。

Fig.2. Complex differential expression of RNAs identified along proximodistal axis of caudal fin.

圖2 沿著尾鰭近端軸識(shí)別的RNAs的差異表達(dá)

        除了遺傳編碼的線(xiàn)索之外，代謝產(chǎn)物可能有助于位置記憶。另外還發(fā)現(xiàn)，幾種代謝酶沿尾鰭的近端軸線(xiàn)差異表達(dá)，包括aldh1l1。此外，近期富集蛋白的GO分析鑒定出與氨基酸代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白質(zhì)(圖3A)。使用質(zhì)譜法分析未損傷尾鰭的近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域的代謝物，單個(gè)魚(yú)鰭樣品中共定量出125種代謝物。PCA將近端和遠(yuǎn)端魚(yú)鰭區(qū)域的代謝物富集聚集成不同的組(圖3B)。幾種代謝產(chǎn)物的豐度在近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間存在差異；26個(gè)近端富集，16個(gè)遠(yuǎn)端富集(圖3C)。

Fig.3. Metabolites are differentially expressed along the proximodistal axis of the fin.

圖3 在鰭的近遠(yuǎn)端軸上差異表達(dá)的代謝產(chǎn)物

        為了檢驗(yàn)這種預(yù)測(cè)，分別于截肢后1、3天(dpa)，在blastema形成期和生長(zhǎng)期(圖4A）對(duì)再生鰭的片段進(jìn)行LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)研究。為了減少魚(yú)類(lèi)之間的潛在變異，作者從同一條魚(yú)中采集了再生鰭的背側(cè)和腹遠(yuǎn)端區(qū)域(雙截肢)。作者發(fā)現(xiàn)3061種蛋白質(zhì)中有97種、11種和2種在0，1和3dpa的背側(cè)和腹側(cè)-遠(yuǎn)側(cè)位置之間差異表達(dá)。在再生過(guò)程中不同時(shí)間蛋白質(zhì)表達(dá)的PCA顯示1和3dpa的樣品聚集成不同的組，在近端或遠(yuǎn)端區(qū)域之間幾乎沒(méi)有變化，而在未損傷的鰭(0dpa)中近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間存在更多變異(圖4B)。然而，在1dpa差異表達(dá)的11種蛋白中，6種在未受損魚(yú)鰭(0dpa)中也差異表達(dá)。編碼這些蛋白質(zhì)的三個(gè)基因aldh1l1，hsd17b7和muc5.2(圖4C)也通過(guò)RNA-seq測(cè)量發(fā)現(xiàn)在未受傷的鰭片中差異表達(dá)。UniProt ID F1R4E4的一種無(wú)特征蛋白質(zhì)，是唯一在0，1和3dpa差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(圖4D)。

Fig.4. Proteomic analyses of proximal and distal regions of regenerating caudal fins identifies proteins that maintain differential expression after injury.

圖4 對(duì)再生尾鰭近端和遠(yuǎn)端區(qū)域的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定損傷后維持差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

總結(jié)

        位置記憶賦予再生組織兩個(gè)關(guān)鍵屬性。首先，離身體近端的截肢比遠(yuǎn)端截肢的再生更快。第二，新的組織是有圖案的。只有損傷部位遠(yuǎn)端的結(jié)構(gòu)才能再生。雖然相當(dāng)多的研究集中在了解不同的生物體是如何開(kāi)始再生的，并且計(jì)算模型已經(jīng)預(yù)測(cè)了位置信息如何調(diào)節(jié)再生生長(zhǎng)，然而關(guān)于位置記憶的細(xì)胞機(jī)制知之甚少。

        跨膜受體Prod1是位置記憶唯一真正的效應(yīng)者。除Prod1外，小分子維甲酸(RA)也被報(bào)道為兩棲類(lèi)肢體位置記憶的效應(yīng)物。盡管有關(guān)Prod1和RA的這些數(shù)據(jù)，但沒(méi)有調(diào)節(jié)位置記憶的分子，在未受傷的附肢中表現(xiàn)出輕微的表達(dá)，并且在物種間保守。普遍假設(shè)預(yù)測(cè)位置記憶機(jī)制的分子梯度存在于未受傷的附肢中。因此，本研究測(cè)定了沿著成年斑馬魚(yú)尾鰭近遠(yuǎn)軸軸線(xiàn)的RNAs，蛋白質(zhì)和代謝物的全局豐度，鑒定了許多不同的圖案分子。這些信息為再生生物學(xué)領(lǐng)域提供了豐富的資源。通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的成魚(yú)組織的一個(gè)軸的基因產(chǎn)物和代謝物的全局模式，并揭示位置記憶的候選效應(yīng)器。候選物列表提供了一種潛在的標(biāo)記物和效應(yīng)因子，它們?cè)诔赡旮街脑偕推鞴俅笮】刂浦衅鹬陵P(guān)重要的作用。

        在脊椎動(dòng)物中，在附肢再生期間適當(dāng)?shù)膱D案化受位置記憶的調(diào)節(jié)一種細(xì)胞特性假定依賴(lài)于未受傷肢體中分子的梯度。只有一個(gè)基因，蠑螈專(zhuān)用，已被證明可以調(diào)節(jié)位置記憶，并在未受傷的肢體中以梯度表達(dá)。確定新的候選人。

        作者繪制了未受傷的斑馬魚(yú)尾鰭上RNAs，蛋白質(zhì)和代謝物的豐度。作者確定了數(shù)百個(gè)分子梯度，并產(chǎn)生了32個(gè)基因和42個(gè)代謝物的高信度列表，這些斑馬魚(yú)是位置記憶的候選效應(yīng)子。此外，這里發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式可能有助于解釋如何在復(fù)雜的成人組織中保持尺寸穩(wěn)態(tài)和圖案。

 

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