研究背景

花羔紅點鮭是溯河產(chǎn)卵魚類，在泛太平洋分布。中國東北部山區(qū)河流中的花羔紅點鮭終身生活在淡水中。早期研究主要集中于花羔紅點鮭的生長和地理分布，而對于淡水花羔紅點鮭抗細菌感染的免疫系統(tǒng)的影響知之甚少。為了探討花羔紅點鮭適應(yīng)淡水對其免疫系統(tǒng)的影響，特別是補體系統(tǒng)（complement system）和Toll-like受體（toll-like receptors，TLR）途徑的影響，本文對細菌侵染的中國淡水花羔紅點鮭進行全長轉(zhuǎn)錄組研究。

材料和方法

• 材料
  中國通化市鴨綠江上游支流取魚（184.6±23.4g），將魚隨機分為兩組，腹腔注射嗜水氣單胞菌或相應(yīng)體積的0.9%鹽水。
• 全長轉(zhuǎn)錄組測序
  腹腔注射后24小時，從細菌注射組中處死3條魚，收集肝臟和脾臟組織等量混合構(gòu)建全長轉(zhuǎn)錄組文庫。
• 測序平臺
  北京百邁客生物科技有限公司PacBio RS II 測序平臺，構(gòu)建3個文庫，0-2kb，2-3 kb和3-6 kb。
• qPCR驗證
  分別于注射后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h各處死3條魚，將肝臟和脾臟組織立即液氮速凍，保存-80℃。

 

研究結(jié)果

 

1、cDNA文庫特征
以中國淡水花羔紅點鮭為材料，將細菌注射魚腹腔法，取肝臟和脾臟等量混樣構(gòu)建cDNA文庫測序。去除接頭序列和低質(zhì)量序列（＜50 bp）之后，產(chǎn)生了超過14.88 GB clean data，總數(shù)為7,728,364。0-2kb，2-3 kb和3-6 kb分別產(chǎn)生4,565,697、2,087,033和1,075,634 clean data。經(jīng)過質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)過濾和去除冗余后，采用31233個高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本獲得27,829個轉(zhuǎn)錄本。共鑒定出24,541個開放閱讀框（ORF），其中17,670個是完整的。

2、轉(zhuǎn)錄本的功能注釋和分類
對27,829個轉(zhuǎn)錄本進行數(shù)據(jù)庫功能富集和分類注釋分析，25,809個轉(zhuǎn)錄本被注釋。NCBI-Nr數(shù)據(jù)庫比對顯示，轉(zhuǎn)錄本匹配到一系列物種（圖1）。Nr數(shù)據(jù)庫中比對上轉(zhuǎn)錄本共有25,653個(92.18%)，52.04% 轉(zhuǎn)錄本與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）相似，其次是大西洋鮭（Salmo salar）(23.53%)和梭子魚（Esox lucius）(14.01%)，其余匹配的物種不到10%。GO數(shù)據(jù)庫注釋16,612個（59.69%）轉(zhuǎn)錄本，富集到兩個與免疫相關(guān)的亞類，分別是“響應(yīng)刺激”（3,124個轉(zhuǎn)錄本）和“免疫系統(tǒng)過程”（851個轉(zhuǎn)錄本）（圖2）。將轉(zhuǎn)錄本與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，共有16917個轉(zhuǎn)錄本富集到271個通路。免疫相關(guān)的KEGG通路主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用（106個基因）、Toll-like受體信號通路（51個基因）、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)（20個基因）等。

圖1 中國花羔紅點鮭肝脾cDNA文庫Nr注釋

圖2 轉(zhuǎn)錄本GO分類

3、免疫相關(guān)基因驗證和鑒定
重新測序驗證了中國原生淡水花羔紅點鮭C4基因（S.m-C4）的完整ORF，長度為5160bp，編碼具有1719個氨基酸(aa)殘基的蛋白質(zhì)。通過兩兩氨基酸序列比較結(jié)果顯示，Salmo salar與中國花羔紅點鮭的同源性最高(94.4%)，相似度最高(88.3%)。
確認了中國原生淡水花羔紅點鮭TLR5基因(S.m-TLR5)的cDNA序列。長度為3123 bp，包括207-bp 5’非翻譯區(qū)域(UTR)，?3’-UTR長度為279 bp，開放閱讀框(ORF) 2640 bp編碼879個氨基酸(圖4)，S.m-TLR5蛋白理論分子量為100.6 kDa。

圖4 S.M－TLR5的核苷酸和預測的氨基酸序列

4、多重序列比對
多重序列比對表明，硬骨魚和人的氨基酸高度保守。推導出的S.m-C4蛋白具有α-β連接子序列RXXR(在殘基668-671)和α-γ。連接序列RRXR（殘基1426-1429），其中C4氨基酸鏈被切割成三個鏈（α，β和γ鏈）。此外，保守的硫酯（GCGEQ）位點也定位在殘基1001至1005（圖5）。預測了TLR5由前21個氨基酸組成的信號肽和由14個氨基酸組成的跨膜螺旋。在膜結(jié)合型TLR5的LRR-CT中發(fā)現(xiàn)4個保守的半胱氨酸殘基，此外，還有9個蛋白結(jié)合區(qū)。結(jié)果表明，S.m-TLR5蛋白與銀大麻哈魚（91.5％）、大西洋鮭（91.7％）和衰白鮭（89.6％）的同源性較高，與鯉魚（48.1％）和金鯽（48.8％）的同源性較低。

圖5 中國淡水花羔紅點鮭與其它物種C4氨基酸序列的多重比對

5、重建系統(tǒng)發(fā)育
為了探究S.m-C4和S.m-TLR5免疫基因在魚類體內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育情況，中國淡水花羔紅點鮭與另外23條硬骨魚、兩條鯊魚和一條腔棘魚用于C4基因研究。重建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育中，四種鮭魚形魚類組合在一起，具有較高的后驗概率（PP）(圖7)。同時三種鯉形目魚類和兩種鰓形目魚類分別用1.00 PP進行分組，形成骨鰾總目分支。這一結(jié)果與傳統(tǒng)分類學和系統(tǒng)發(fā)育相一致。硬骨魚分為鰓形目、原鰓形目、鰓形目和棘鰓目四支，其中，兩條鯊魚是外群。

圖7 重建C4基因貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育

6、分子進化分析
首先，利用位點模型探討C4基因中是否存在因其不同的分類地位和生存環(huán)境而正向選擇的位點。在模型中，只有M1a-M2a和M7-M8能夠檢測到正向選擇位點。M7-M8檢測到PP > 0.95的10個正向選擇位點，其中9個位點也被M1a-M2a檢測到，表明魚C4基因的正向選擇。其次，利用分枝模型來探究這些正向選擇事件是否發(fā)生在特定的魚類譜系上，從而導致現(xiàn)在的魚或者祖先魚類。最后，利用分枝位點模型，在特定的現(xiàn)在和祖先譜系中檢測了這些位點。對于C6基因，M7-M8在正選擇壓力下僅檢測到一個位點，而花羔紅點斑鮭或其他冷水魚中的分支位點未檢測到任何正選擇位點（表8）。

表8 魚C4和C6基因的位點、分枝和分枝位點模型試驗

7、qPCR驗證相對表達量
為探討這兩種免疫基因在細菌侵入的免疫應(yīng)答，采用定量實時PCR（qPCR）技術(shù)，觀察注射后96h內(nèi)肝、脾臟相關(guān)基因的表達。對于鹽水處理組，即對照組，S.m-C4基因在研究的所有時間點肝臟中均無顯著差異（圖9）。對于嗜水氣單胞菌注射組，即實驗組，肝臟在24小時有顯著增加（p=0.04），在12小時和72小時出現(xiàn)兩個峰值，邊緣顯著。在6h、12h、24h和72h，實驗組與對照組有顯著性差異。對照組脾臟中S.m-C4基因的相對表達上下波動，8個時間點之間差異不顯著，實驗組脾臟中S.m-C4基因的相對表達除72h外，其余時間點均無差異，與細菌注射組0 h相比減少59.6%。

圖9 嗜水氣單胞菌或鹽作用肝臟中S.m-C4相對表達量

 

結(jié)論

 

1、本研究以細菌侵染后中國淡水花羔紅點斑鮭為材料，構(gòu)建了全長轉(zhuǎn)錄組文庫。經(jīng)過質(zhì)量控制，從31,233個高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本中共獲得27,829個轉(zhuǎn)錄本，并鑒定出24,541個開放閱讀框（ORF），其中17,670個完整。

2、將27,829個轉(zhuǎn)錄本用于功能富集和分類分析，25,809個轉(zhuǎn)錄本得到注釋。相對于適應(yīng)免疫基因，注釋到更多先天免疫相關(guān)基因。參與Toll-like受體信號通路的基因多于補體和凝血級聯(lián)，表明Toll-like受體在細菌侵染的淡水花羔紅點鮭中發(fā)揮更重要的免疫作用。

3、為驗證全長轉(zhuǎn)錄組鑒定基因序列準確性，選擇S.m-C4和S.m-TLR5進行重新測序驗證，進一步證明測序結(jié)果的準確性。

4、中國淡水花羔紅點鮭中TLR和補體系統(tǒng)顯著數(shù)量差異，可能是TLR和補體系統(tǒng)進化壓力模式的不同所致，以TLR3和TLR5以及C4和C6為代表，它們分別處于純化選擇和正選擇壓力。

 

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