圖1. 1994年和2015年收獲的大豆種子五個(gè)胚胎的電泳圖

2、 轉(zhuǎn)錄本選取
測(cè)序結(jié)果顯示，每個(gè)flowcell的測(cè)序數(shù)據(jù)量超過2百萬個(gè)cDNA分子，約97％的分子被轉(zhuǎn)換為核苷酸序列，共保留了3,559,336個(gè)具有barcode的序列。1994H和2015H樣本之間的平均reads沒有顯著差異。1994H或2015H樣品中分別比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組的reads數(shù)量相似（分別為1 649 345和1 819 173）。1994H種子中3409個(gè)轉(zhuǎn)錄本特異表達(dá)，2015H種子中4127個(gè)轉(zhuǎn)錄本特異表達(dá)。參考基因組轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度和測(cè)序轉(zhuǎn)錄本呈正相關(guān)。1994H的相關(guān)性較弱，特別是對(duì)于較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本，表明轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度短于預(yù)期（圖2B）。

圖2. 10個(gè)樣品中11 729個(gè)轉(zhuǎn)錄本的參考轉(zhuǎn)錄本和測(cè)序轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度比較

3、mRNA降解模式
通過每個(gè)堿基的讀數(shù)，將2211個(gè)轉(zhuǎn)錄本分成不同的降解模式（圖3）。在2015H和1994H樣品中，未顯示降解跡象的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出幾乎一樣的測(cè)序深度，在儲(chǔ)存期間降解的轉(zhuǎn)錄本在2015H樣品中具有恒定的測(cè)序深度，而在1994H樣品中靠近3’末端的測(cè)序深度增加（圖3B），或者在兩個(gè)群組中測(cè)序深度以不同的速率增加（圖3C）。 無論儲(chǔ)存時(shí)間如何，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度都與降解相關(guān)。

圖3. 比較2015H和1994H每個(gè)位置的轉(zhuǎn)錄本reads之間的平均歸一化測(cè)序深度

? ? ? 區(qū)域A在儲(chǔ)存23年后無變質(zhì)跡象，其中172個(gè)轉(zhuǎn)錄本小于1200 bp。區(qū)域A’包含1149個(gè)轉(zhuǎn)錄本，大多數(shù)（853）轉(zhuǎn)錄本小于1200 bp，剩余的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度1200-2500bp。區(qū)域B包括114個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在2015H樣品中比較完整但是在1994H樣品中降解，大多數(shù)（108）具有中等長(zhǎng)度。區(qū)域C在1994H樣品中的降解多于2015H樣品。長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本61個(gè)，中間轉(zhuǎn)錄本38個(gè)。無小于1200bp 的轉(zhuǎn)錄本。區(qū)域D包括最初降解的104個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在23年的儲(chǔ)存期間幾乎沒有變化。64個(gè)轉(zhuǎn)錄本具有可變剪接模式。在區(qū)域A的轉(zhuǎn)錄本中，20個(gè)GO term顯著表達(dá)，主要與核糖體功能和翻譯有關(guān)。區(qū)域C中，轉(zhuǎn)錄本具有顯著的ATP結(jié)合term和相關(guān)功能的過表達(dá)。

圖4. 隨時(shí)間發(fā)生的降解與在儲(chǔ)存早期發(fā)生的降解之間的關(guān)系

4、鳥嘌呤核苷酸氧化
來自5’末端的轉(zhuǎn)錄本降解可以反映年齡相關(guān)的RNA氧化。最容易氧化的堿基，8-oxo-guanosine的豐度與總RNA中鳥苷豐度的比例與1989,1995,1999和2015年收獲的大豆種子胚軸的貯藏時(shí)間無關(guān)（圖5）。

圖5. 大豆種子胚軸貯藏時(shí)間中RNA的氧化

5、 qPCR驗(yàn)證
通過qPCR的方法對(duì)區(qū)域A（無降解）的三種轉(zhuǎn)錄本和區(qū)域B的三種轉(zhuǎn)錄本（僅在1994H種子組織中顯著降解）的完整性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：區(qū)域A的轉(zhuǎn)錄本，在組內(nèi)cDNA文庫(kù)中5’和3’擴(kuò)增的cDNA模板相似，且三個(gè)cDNA文庫(kù)ΔCt值沒有差異，樣本2015H和1994H之間有較小差異。與完整轉(zhuǎn)錄本相反，對(duì)于易于降解的轉(zhuǎn)錄本，ΔCt值在群組之間顯著不同（區(qū)域B）。在1994H樣品中，5’比3’擴(kuò)增模板豐度低，產(chǎn)生負(fù)ΔCt值，在2015H樣品中，兩種擴(kuò)增模板豐富度相似。

圖6. 使用qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄本降解

討論

在相隔21年的種子的胚軸中比較mRNA的降解，2015H和1994H分別顯示未衰老和增加衰老癥狀。使用全分子cDNA無打斷的測(cè)序方法對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序。發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄本在兩個(gè)群組中均有降解，但在1994H種子的組織中觀察到更多的損傷。損傷主要由于片段碎裂造成，如電泳圖譜的變化，轉(zhuǎn)錄本覆蓋長(zhǎng)度和測(cè)序深度所示。幾乎沒有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄本丟失或引起了氧化損傷。降解轉(zhuǎn)錄本中片段大小的連續(xù)分布以及轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度和降解之間的正相關(guān)支持了通過隨機(jī)片段化造成mRNA降解的假設(shè)，這與氧化事件引起死亡的假設(shè)一致。

參考文獻(xiàn)：
Fleming M B , Patterson E L , Reeves P A , et al. Exploring the fate of mRNA in aging Seeds: Protection, Destruction, or Slow Decay?[J].?Journal of Experimental Botany, 2018, 69(18):4309-4321.