文章題目：Comparison Between theFecal Bacterial Microbiota of Healthy and Diarrheic Captive Musk Deer
合作單位：北京林業(yè)大學(xué)
雜志名稱：Frontiers in Microbiology
影響因子：4.019
麝（shè）
研究背景
麝（shè）（Noschus noschiferus?Linnaeus），又稱為麝獐、香獐，種類少，麝的前肢短，后肢長，蹄小耳大，雌雄都無角，雄性有發(fā)達(dá)獠牙。麝棲居于山林，多在拂曉或黃昏后活動(dòng)，聽覺、嗅覺均發(fā)達(dá)。雄麝臍香腺囊中的分泌物干燥后形成的香料即為麝香，是一種十分名貴的藥材，也是極名貴的香料。麝的數(shù)量急劇下降，因?yàn)槿藗優(yōu)榱双@得麝香而不斷獵殺它們。
我國森林麝的養(yǎng)殖主要分布在兩個(gè)地區(qū)：陜南秦嶺山區(qū)和四川西部山區(qū)。自1958年以來，中國一直在試驗(yàn)森林麝（Moschus berezovskii）養(yǎng)殖，并在過去幾十年中在許多方面取得了重大進(jìn)展。養(yǎng)殖麝的最初目標(biāo)是減少野生麝鹿資源的壓力，以獲得有價(jià)值的麝香。隨著野生麝數(shù)量的急劇減少，人工繁殖的麝種群也將構(gòu)成一種重新引入的重要來源。然而，人工繁殖的森林麝種群長期受到健康不穩(wěn)定和疾病發(fā)病率高等因素的影響。腹瀉是人工繁殖的森林麝中最常見的疾病之一。在一些麝養(yǎng)殖場中，嚴(yán)重的腹瀉可導(dǎo)致死亡，腹瀉的死亡率達(dá)到30％。因此，近年來，腹瀉已成為人工繁殖麝的疾病預(yù)防和控制的重點(diǎn)，雖然相關(guān)研究仍然缺乏。
大量研究表明，哺乳動(dòng)物腸道疾病的發(fā)生與腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。腸道微生物是構(gòu)成宿主內(nèi)微生物的主要部分。已經(jīng)證明腸道微生物群落能夠幫助結(jié)腸發(fā)酵，刺激免疫系統(tǒng)，防御病原體入侵和改善能量獲取，對(duì)宿主的健康和營養(yǎng)有重要作用。因此，腸道微生物的群落動(dòng)態(tài)是保證寄主生理穩(wěn)態(tài)的重要因素。當(dāng)正常的微生物群受到外源有害微生物的影響時(shí)，其自我平衡將被破壞，這可能導(dǎo)致消化紊亂甚至誘發(fā)宿主疾病。本研究通過利用高通量16S-rRNA基因測序技術(shù)，全面分析和比較健康和腹瀉森林麝糞便微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)，旨在為預(yù)防和控制麝香鹿的腹瀉提供了科學(xué)的理論依據(jù)，對(duì)改善圈養(yǎng)麝鹿的健康狀況具有重要意義。
材料與方法
1、試驗(yàn)材料：選擇了4-6歲的成年森林麝鹿，包括8只健康麝（HMD）（編號(hào)H1-H8），8只輕度腹瀉麝（MMD）（編號(hào)M1-M8），和5只嚴(yán)重腹瀉的麝（SMD）（編號(hào)S1-S5）。共收集了21份糞便樣本。2、試驗(yàn)方法：Illumina HiSeq 2500?，16SV3+V4
結(jié)果與分析
FIGURE 1 |?Boxplotand rarefaction curves of operational taxonomic units (OTUs).
2、健康和腹瀉的森林麝之間微生物多樣性的差異分析
麝鹿糞便樣本中Alpha多樣性指數(shù)（Ace，Chao 1，Simpson和Shannon）（圖2）和健康和腹瀉的樣本β多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：HMD和MMD之間的Ace、Chao 1、Simpson和Shannon指數(shù)存在顯著差異（P <0.05）。MMD和SMD之間沒有顯著性差異。HMD和SMD的比較發(fā)現(xiàn)有顯著性差異（P <0.05）。
FIGURE 2 | Boxplot ofAlpha-diversity indices. Alpha diversity indexes are composite indexesreflecting abundance and consistency.
β多樣性用于分析物種組成的時(shí)間和空間變化，反映群體間細(xì)菌群落是否存在差異。NMDS圖顯示了微生物群落的不同，并揭示了腹瀉和健康麝鹿之間的獨(dú)特結(jié)構(gòu)（圖3）。
FIGURE 3 | Non-metricmultidimensional scaling (NMDS) analysis.
組間和組內(nèi)β距離在箱型圖中顯示（圖4），結(jié)果表明HMD和MMD組（圖4A）之間以及HMD和SMD組之間細(xì)菌群落的極顯著差異（圖4B）（?P <0.01）。
FIGURE 4 | Box plot ofInter-group and Intra-group Beta distance (ANOSIM Analysis).
3、核心微生物組成及相對(duì)豐度
物種分類柱狀圖是表示HMD、MMD和SMD樣本中物種的組成及對(duì)應(yīng)物種在該樣本中的相對(duì)豐度。HMD、MMD和SMD樣本中在門水平和屬水平相對(duì)豐度前10的物種如圖5所示。無論是否存在腹瀉的樣本中，厚壁菌和擬桿菌都是主要的優(yōu)勢菌。然而，健康森林麝的糞便中厚壁菌的相對(duì)豐度明顯高于腹瀉麝。厚壁菌是構(gòu)成食物中纖維素分解代謝并將纖維素降解為宿主揮發(fā)性脂肪酸的主要細(xì)菌類型。此外，厚壁菌門還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)，抑制病原體的侵襲和預(yù)防腸道炎癥。腹瀉麝腸道中厚壁細(xì)胞豐度的減少可能會(huì)同時(shí)降低該物種的消化生理功能。另外，β多樣性的比較顯示，健康和腹瀉森林麝的細(xì)菌群落差異極顯著，這與麝的異常消化生理功能有關(guān)。HMD、MMD和SMD三組不同樣本之間共有OTU和特有OTU數(shù)量如圖6所示。
FIGURE 5 | Histogram of relativeabundance. The x-axis represents groups and the y-axis represents relativeabundance presented as percentage.
FIGURE 6 | Venn diagram.
4、健康與腹瀉森林麝的顯著差異分析及功能基因預(yù)測
LefSe分析表明（圖7），在屬的水平上，MMD組與HMD和SMD組之間顯著性差異較大的菌種為埃希氏菌?–?志賀氏菌。埃希氏菌屬?–?志賀氏菌是常見的病原體，其主要的傳播途徑包括：受感染對(duì)象的糞便、食物和含有細(xì)菌的水。該病原體可引起結(jié)腸粘膜炎癥，導(dǎo)致腹痛、腹瀉和形成粘膜糞便等癥狀。因此，用于喂養(yǎng)麝的食物和水以及糞便管理是減輕輕度腹瀉的關(guān)鍵。另外，SMD組與HMD和MMD組之間顯著性差異較大的菌種為梭桿菌。梭桿菌是炎癥性微生物，它可抑制體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答并促進(jìn)炎性因子的表達(dá)。比較MMD組和SMD組，可以推測Fusobacterium可能在輕度腹瀉的背景下增殖并成為主要病原體。因此，森林麝的腸道生理紊亂與其主要病原體的類型是存在一定的相關(guān)性的。
FIGURE 7 | LefSe analysis.
使用PICRUSt軟件通過比對(duì)16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異（圖8）。與HMD相比組，免疫疾病代謝途徑中功能基因的豐度在腹瀉森林麝中顯著增加。腸道微生物的存在可以刺激宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育，增強(qiáng)宿主免疫功能，禁止病原微生物入侵。而腸道微生物引起的腹瀉可以影響宿主的免疫能力，從而增加對(duì)免疫疾病的易感性。此外，它還可能對(duì)宿主中生物系統(tǒng)的細(xì)胞免疫過程和代謝途徑產(chǎn)生影響。更加深入的研究還需以宏基因組分析來確認(rèn)基因功能信息的準(zhǔn)確性。
FIGURE 8 | (A) The abundance ratio ofdifferent functions between HMD and MMD. (B) The abundance ratio of differentfunctions between HMD and SMD.
結(jié)論
腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)與組成較為復(fù)雜，腹瀉森林麝鹿糞便中微生物種類較健康麝多，由許多潛在的原因?qū)е碌?。除了我們此?xiàng)研究的細(xì)菌病原體外，還可能是由于病毒、腸易激綜合征（IBS）等因素導(dǎo)致。因此該項(xiàng)目更深一步的研究還要根據(jù)宏基因組測序手段來進(jìn)行研究。本研究通過利用高通量16S-rRNA基因測序技術(shù)，全面分析和比較健康和腹瀉森林麝糞便微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)，旨在為預(yù)防和控制麝香鹿的腹瀉提供了科學(xué)的理論依據(jù)，對(duì)改善圈養(yǎng)麝鹿的健康狀況具有重要意義。
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參考文獻(xiàn)：
YimengL , Xiaolong H , Shuang Y , et al. Comparison Between the Fecal BacterialMicrobiota of Healthy and Diarrheic Captive Musk Deer[J]. Frontiers inMicrobiology, 2018, 9:300-.
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