代謝組學(xué)是目前用于作物改良的新興技術(shù)之一。它使人們對(duì)復(fù)雜的生物過程網(wǎng)絡(luò)有了一個(gè)全面的理解，這無(wú)疑有助于理解生物過程的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，可持續(xù)加快作物生產(chǎn)。代謝組學(xué)優(yōu)勢(shì)包括能夠研究整個(gè)代謝物譜的變化，了解不同代謝物的作用和調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致增產(chǎn)、非生物和生物脅迫耐性、抗病性、種子組成和風(fēng)味豐富。

代謝物的改變同時(shí)也影響個(gè)體表型的變化，因此，代謝物可以當(dāng)做一種“微觀”表型，并利用大量的分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行QTL定位，我們稱之為mQTL（metabolome Quantitative Trait Locus，代謝數(shù)量性狀基因座）。

mQTL目前多應(yīng)用于擬南芥、水稻、小麥、番茄[1-4]等蔬菜作物，近期圖譜君在碼文獻(xiàn)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)一篇今年剛發(fā)表的多年生草本果樹mQTL案例，馬上就想跟大家分享一下，主要內(nèi)容就是利用草莓種內(nèi)構(gòu)建F1群體結(jié)合初級(jí)代謝產(chǎn)物以及品質(zhì)性狀的表型進(jìn)行QTL和mQTL共定位，找到糖、酸和Vc候選基因。

 

研究背景

草莓是世界上最重要的軟果作物之一，其品質(zhì)在很大程度上取決于果實(shí)的成熟過程。在果實(shí)發(fā)育過程中，花托在生長(zhǎng)素的的刺激下經(jīng)歷了分裂、膨脹和成熟階段，從而積累了糖、有機(jī)酸和揮發(fā)物。因此，成熟草莓因其獨(dú)特風(fēng)味而受到高度重視，同時(shí)其也是糖、礦物質(zhì)、維生素和抗氧化化合物的重要來源。

提高果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和感官品質(zhì)是目前草莓育種計(jì)劃的一個(gè)重要目標(biāo)，本研究利用F1群體研究草莓果實(shí)初級(jí)代謝相關(guān)代謝性狀的變異和遺傳控制。

材料與方法

材料：八倍體草莓，“232”和“1392”進(jìn)行種內(nèi)雜交得到F1群體，每個(gè)親本或F1分別種植6株（營(yíng)養(yǎng)繁殖）

性狀：2年表型（2013和2014年），初級(jí)代謝產(chǎn)物、維生素（L-AA）和關(guān)鍵果實(shí)品質(zhì)性狀（可溶性固形物SSC、可滴定酸TA以及PH）

表型測(cè)量：2013和2014年連續(xù)在春/秋中旬中同一天收獲熟果，每行收20-25個(gè)完全成熟的果實(shí)并混成3次生物學(xué)重復(fù)，用GC-MS檢測(cè)和半定量初級(jí)代謝產(chǎn)物

標(biāo)記開發(fā)：DArT 測(cè)序開發(fā)的SNP和SSR標(biāo)記，參考基因組為F. vesca v4.0.a1

圖譜構(gòu)建及QTL定位：JoinMap 4.1和MapQTL 5.0的rMQM算法

表達(dá)分析：qRT-PCR（2個(gè)親本及10個(gè)子代）和RNA-seq（分別混合8個(gè)LAA高的個(gè)體和8個(gè)LAA低的個(gè)體，三次生物學(xué)重復(fù)）

代謝分析：雙親及F1群體果實(shí)中相對(duì)代謝物含量

結(jié)果與分析

1、表型分析

雖然利用Shapiro–Wilk 測(cè)驗(yàn)，所有代謝產(chǎn)物的表型分布并不都是正態(tài)分布，但是其在子代群體均呈現(xiàn)連續(xù)變異，表明其為數(shù)量性狀。

2、代謝分析

對(duì)2013和2014年的層序聚類分析，發(fā)現(xiàn)F1群體變異范圍超過雙親，且分為近似相等的3大類，分別為糖及糖衍生物（A類）、氨基酸（B類）和多種化合物（C類）。并將2年的代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)2年中2個(gè)季節(jié)的極顯著相關(guān)（P<0.05）

圖1、代謝分析結(jié)果

3、mQTL定位

得到含有2089個(gè)標(biāo)記，33條連鎖群的遺傳圖譜，總長(zhǎng)為2489 cM ，平均圖距為1.34cM，其中33條連鎖群對(duì)應(yīng)草莓基因組的28條染色體。利用2007、2008和2009年的果實(shí)品質(zhì)性狀（SSC、L-AA和TA和PH）和2年代謝表型均值進(jìn)行QTL定位和mQTL定位。47個(gè)性狀定位到133個(gè)獨(dú)有的QTL位點(diǎn)。

圖2 QTL和mQTL定位結(jié)果

4、聯(lián)合分析

糖相關(guān)QTL和mQTL結(jié)果聯(lián)合分析，在LG V的13-26cM內(nèi)找到同時(shí)控制蔗糖和棉子糖的位點(diǎn)（qSuc-V-4和 qRaf-V-4），位于草莓基因組chr5的1,822,882–7,927,246 bp，含有1097個(gè)基因。通過注釋發(fā)現(xiàn)，12個(gè)與糖的生物合成、代謝或運(yùn)輸相關(guān)的基因。根據(jù)前人研究結(jié)果，選定7個(gè)基因用于qRT-PCR分析。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)FvH4_5g03890基因表現(xiàn)出顯著差異。

酸相關(guān)QTL和mQTL結(jié)果聯(lián)合分析，在LG V的18.18-25.6cM內(nèi)找到控制琥珀酸的QTL位點(diǎn)（qSa-V-4），通過注釋找到FvH4_5g09730基因，但其表達(dá)無(wú)差異。但由于與糖定位結(jié)果存在交集，有可能是一因多效。

圖3 表達(dá)分析結(jié)果

5、L-AA候選基因Mannose-6-P-isomerase

通過本實(shí)驗(yàn)之前的研究定位結(jié)果和mQTL定位結(jié)果聯(lián)合，在LG V的38.6-48.8 cM上找到一個(gè)與L-AA相關(guān)的QTL位點(diǎn)qLAA-V-1，位于chr5的8,160,286-13,129,181 bp，含有732個(gè)基因，通過注釋找到2個(gè)相關(guān)基因FvH4_5g20650和FvH4_5g21090（Mannose-6-P-isomerase）。利用F1的2個(gè)混樣RNA結(jié)果驗(yàn)證FvH4_5g21090（FaM6PI1）為候選基因，并利用qRT-PCR驗(yàn)證進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖4 表達(dá)分析結(jié)果

總結(jié)

本文利用F1群體構(gòu)建遺傳圖譜，對(duì)50種初級(jí)代謝產(chǎn)物及主要果實(shí)品質(zhì)性進(jìn)行QTL和mQTL定位，聯(lián)合分析分別鎖定與控制糖、酸和L-AA相關(guān)的候選基因，然后利用RNA-seq和qRT-PCR進(jìn)行候選基因的驗(yàn)證。其實(shí)看起來也比較簡(jiǎn)單，但是勝在表型的多樣化及多年數(shù)據(jù)，其實(shí)存在困難的地方在于群體的代謝物測(cè)量，還有可測(cè)量代謝物的種類，有些物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品還是很難弄到的，本文只測(cè)量了初級(jí)代謝物，如果也能測(cè)量次級(jí)代謝物那就更好了，多維度考查表型，從而揭示某一個(gè)性狀的調(diào)控機(jī)制已成為目前主流手段。

 

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參考文獻(xiàn)：

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doi: 10.1038/s41438-018-0077-3

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