對于高通量技術大家一定都不陌生，但生物信息分析之后該做什么呢？接下來的日子，小編會和大家探討并分享高通量測序后的實驗驗證，即該用什么技術做什么驗證！
關于實驗小編也是初來乍到，今天先和大家探討最常見的轉錄組測序后的驗證方法。轉錄組的驗證方法有點多（如表達量驗證、亞細胞定位、RNA結合蛋白、功能獲得驗證、功能缺失驗證等），本篇只先介紹表達量驗證、RNA結合蛋白、亞細胞定位，其余的下期見！
表達量驗證
一般情況我們優(yōu)先選擇高表達量的RNA，以及差異表達明顯的RNA去驗證。去驗證某個基因或者RNA的表達量時，需要保證沒有基因組DNA的污染。PS:如果是非編碼RNA驗證，由于他們可能不含polyA尾巴，所以要注意反轉錄方式。
qRT-PCR
設計引物RNA進行qRT-PCR。
哈哈哈，如果你和小編一樣曾是生信dog，我相信你一定一臉懵逼，我連PCR到底是啥能干啥都不知道，你跟我說qRT-PCR!
小編以一個實驗編外人士跟你通俗易懂的科普一下，PCR是設計引物判斷某個DNA序列是否存在的技術；RT-PCR對RNA進行反轉錄（Reverse transcription）得到cDNA后，以cDNA為模板進行PCR反應，進而判斷某個RNA序列是否存在的技術；qPCR不只判斷DNA是否存在，還能判斷含量高低，qRT-PCR即quatitative RT-PCR，是判斷RNA是否存在以及含量高低的技術！
總結一句話，PCR都得設計引物，帶RT就是研究RNA,不帶RT就是研究DNA，帶q就是定量，不帶q就是定性！至于他是咋定量的呢，劃重點，靠內參！！
小編已經快被自己總結能力所折服了！
Northern blot
Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。PS:?Northern blot樣品需除去RNA酶。
小編再給大家科普一下下，Western Blot做蛋白，Southern Blot做DNA，Eastern blotting是Western Blot的變形也是作蛋白，不過沒得到廣泛認可。
靈敏度：qRT-PCR?>?Northern blot
特異性：Northern blot?>?qRT-PCR
RNA和蛋白互作驗證
RNA結合蛋白（RNA?Binding?Protein）是一類伴隨RNA的調控代謝過程，與RNA結合的蛋白質的總稱。RBP伴隨RNA生命始終，其主要作用是介導RNA的成熟、轉運、定位和翻譯；一個RBP可能存在多種靶標RNA；且其表達缺陷會造成多種疾病。RNA與蛋白相互作用是RNA功能研究的焦點問題之一。
RNA-pull down
已知RNA，尋找結合蛋白。
RNA?pull-down實驗就是先將RNA進行標記（如生物素探針標記）再與蛋白共同孵育，從而形成RNA-蛋白質復合物，通過SDS-PAGE分離蛋白質，最后通過WB(western?blot)或質譜（mass?Spectrometry）檢測蛋白質。
該技術用于尋找與目的RNA結合的蛋白。
RIP
已知蛋白，尋找RNA。
RIP（RNA?Binding?Protein?Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀）技術采用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，經分離純化對RNA進行分析。
該技術用于尋找與目的蛋白結合的RNA。
EMSA
已知RNA,已知蛋白，判斷是否結合。
EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，凝膠遷移）技術是通過凝膠電泳遷移檢測蛋白-RNA互作的一種技術。
首先將設計好的帶有標記的RNA探針與樣本蛋白混合孵育，形成蛋白-RNA復合物。因復合物分子量大，會在聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結合蛋白的探針則較快。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，來確定RNA結合蛋白的特異性。
該技術用于體外驗證預測的RNA與蛋白之間是否能夠結合。
亞細胞定位研究
亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位，例如在核內、胞質內或者細胞膜上存在。越來越多的證據(jù)顯示，在生物學過程中位于不同的亞細胞器RNA擁有不同的功能，亞細胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能。
RNAFISH
RNAFISH，即RNA的免疫熒光原位雜交，是將已標記的RNA探針（可在探針上標記熒光基團、生物素、地高辛等）與組織切片或細胞中的待測RNA中的互補序列雜交,從而對組織細胞中的RNA進行定性、定位和相對定量分析。
數(shù)據(jù)庫
小編偷偷的告訴你（雖然有可能你早就知道），RNALocate數(shù)據(jù)庫（http://www.rna-society.org/rnalocate）收錄了超過42,000個人工收集的RNA的亞細胞定位信息，包含超過23,100個RNA，在65個物種中的42個亞細胞定位。lncATLAS數(shù)據(jù)庫（http://lncatlas.crg.eu/）則是一個專門收錄lncRNA亞細胞定位的數(shù)據(jù)庫。有需要的可以先去查詢！
休息休息一下~這一期就到這里吧~
下期關于轉錄組相關的實驗驗證如功能獲得&缺失、細胞模型&動物模型見！
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參考文獻：
Zhang?T?,?Tan?P?,?Wang?L?,?et?al.?RNALocate:?A?resource?for?RNA?subcellular?localizations[J].?Nucleic?Acids?Research,?2016,?45(Database?issue).
Mas-Ponte?D,?Carlevaro-Fita?J,?Palumbo?E,?Pulido?TH,?Guigo?R,?Johnson?R.?LncATLAS?database?for?subcellular?localization?of?long?noncoding?RNAs.?Rna.?2017?Jul?1;23(7):1080-7.
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