本文為大家分享一個(gè)基于nanopore平臺(tái)檢測(cè)新合成isoform及其穩(wěn)定性的技術(shù)。

真核基因通常產(chǎn)生多種RNA isoform，其可產(chǎn)生功能上不同的蛋白質(zhì)變體。然而，RNA isoform的合成和穩(wěn)定性鮮少了解。原因是目前量化RNA代謝的方法是不能檢測(cè)RNA isoform的“短讀長(zhǎng)”測(cè)序。

因此作者開(kāi)發(fā)了nano-ID（nanopore sequencing-based Isoform Dynamics ），其結(jié)合了代謝RNA標(biāo)記、天然RNA分子的“長(zhǎng)讀長(zhǎng)”納米孔測(cè)序和機(jī)器學(xué)習(xí)。

一個(gè)主要挑戰(zhàn)是尋找合適的核苷類(lèi)似物用于RNA標(biāo)記和檢測(cè)標(biāo)記的RNA isoform，已知標(biāo)記效率限制在約2-3％，即100個(gè)天然核苷酸中只有2個(gè)或3個(gè)被核苷酸類(lèi)似物取代。作者利用ERCC標(biāo)準(zhǔn)品，分別以添加核苷酸類(lèi)似物和不添加的天然堿基作體外轉(zhuǎn)錄，將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行nanopore direct RNA測(cè)序，比較了幾種不同的核苷酸類(lèi)似物：5EU(5-Ethynyluridine，5-乙炔基尿苷)、5BrU(5-bromouridine，5-溴尿苷)、5IU(5-iodouridine，5-碘尿苷)、4sU(4-thiouridine，4-硫代尿苷)和?6sG(6-thioguanine，6-硫鳥(niǎo)嘌呤)。最終結(jié)果表明：5EU和5IU標(biāo)記檢出率比較高，且5EU對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。且5EU標(biāo)記的新合成RNA中約有一半U(xiǎn)可以被識(shí)別為5EU，且從原始電信號(hào)中可以明顯區(qū)分5EU和天然U堿基。選用5EU進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

整體的nano-ID方法如下，作者在人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562中進(jìn)行了體內(nèi)研究：5EU處理60min組、5EU處理24h組和未處理組。同時(shí)，作者進(jìn)行了polyA長(zhǎng)度分析。

熱休克反應(yīng)（42°C 60min）處理，許多RNA isoform改變了合成速率、穩(wěn)定性和剪接模式。nano-ID分析結(jié)果表明，對(duì)于某一個(gè)基因座對(duì)應(yīng)的組合RNA混合物（基因水平）的代謝變化與單一轉(zhuǎn)錄本代謝變化差異非常大。雖然組合的RNA穩(wěn)定性與poly（A）尾巴長(zhǎng)度相關(guān)，但是單個(gè)RNA isoform可以顯著偏離。nano-ID能夠在不同細(xì)胞狀態(tài)和條件下研究單個(gè)RNA分子和isoform水平的RNA代謝。

 

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