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2019年7月22日,Nanopore平臺(tái)全新測(cè)序芯片R10到達(dá)百邁客實(shí)驗(yàn)室,百邁客將開啟ONT平臺(tái)測(cè)序新征程!

近年來(lái),由于三代測(cè)序相較于二代測(cè)序,擁有單分子無(wú)需擴(kuò)增,長(zhǎng)度長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì),因此在各組學(xué)研究中大放異彩。而作為三代測(cè)序的代表技術(shù)之一,Nanopore平臺(tái)因能獲得更長(zhǎng)讀長(zhǎng),在基因組學(xué)研究中更是備受青睞。但相較于二代平臺(tái),三代平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性一直是比較大的劣勢(shì)。本次Oxford Nanopore Technologies公司即將推出的R10芯片,則劍指準(zhǔn)確性。相較于當(dāng)前廣泛使用的R9.4.1芯片,新型R10芯片可提供相當(dāng)?shù)淖x長(zhǎng),產(chǎn)量及更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

R10芯片測(cè)序原理

新升級(jí)R10芯片大的更新是納米孔采用了雙讀取器(Reader)的設(shè)計(jì),能夠?qū)ν粔A基進(jìn)行兩次信號(hào)識(shí)別。理論上,同一堿基的識(shí)別次數(shù)為R9.4.1版本芯片2倍,由此來(lái)增加堿基的判斷率,減小隨機(jī)錯(cuò)誤,并提高一致準(zhǔn)確性。R10與R9.4.1測(cè)序方式比較如圖1

圖1??測(cè)芯片更新前后測(cè)序方式比較
R10數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性到底如何呢,目前的信息具體如下:

01、單reads測(cè)序準(zhǔn)確性:

目前主流的R9.4.1芯片的表現(xiàn)能力如何?我們隨機(jī)抽取了200個(gè)已經(jīng)完成常規(guī)ONT DNA測(cè)序的樣品(包含各種動(dòng)植物)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),總共約22.4T數(shù)據(jù)(足夠有代表性了),結(jié)果如下:

可以看到,R9.4.1芯片數(shù)據(jù)的讀長(zhǎng)是非常理想的:Reads N50高達(dá)到72 Kb,平均達(dá)到35 Kb;單分子讀長(zhǎng)高達(dá)到了1.6 Mb;而關(guān)于質(zhì)量值平均為8.3,對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為:85.21%;單個(gè)樣品平均質(zhì)量值高達(dá)到9.7,對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為:89.28%;

R10的質(zhì)量表現(xiàn)如何呢?我們統(tǒng)計(jì)了拿到的四個(gè)樣品的數(shù)據(jù),具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見下圖:

圖2 R10數(shù)據(jù)質(zhì)量值分布

絕大部分R10 reads的質(zhì)量值達(dá)到了10以上(對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為90.0%),而平均質(zhì)量值為12.1(對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為93.8%),而reads質(zhì)量值已經(jīng)達(dá)到了15以上(對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為96.84%)。由此可見,對(duì)于單條reads來(lái)說(shuō),提升還是非常明顯的,平均reads準(zhǔn)確性從85%提升到了93.8%。

02、Consensus序列準(zhǔn)確:

看完單條reads準(zhǔn)確性后,那么組裝時(shí)用到的高深度consensus序列準(zhǔn)確性怎么樣呢?官方比較了同一樣本不同芯片測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,見圖3。從結(jié)果可知,相同測(cè)序深度的情況下,consensus后序列的準(zhǔn)確性Q值,R10比R9.4.1提升了5~10之間,對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)確性有的提升了1個(gè)百分點(diǎn)之多。

圖3?不同物種中R10和R9.4.1 reads準(zhǔn)確度

從官方的數(shù)據(jù)顯示,當(dāng)數(shù)據(jù)深度為50X時(shí),R10測(cè)序數(shù)據(jù)的consensus序列的準(zhǔn)確性已經(jīng)達(dá)到了Q44,即99.996%以上(圖4)。且隨著測(cè)序深度的增加,R10芯片一致準(zhǔn)確性逐漸增加。官方對(duì)多物種測(cè)試發(fā)現(xiàn),在100X的測(cè)序深度下,consensus準(zhǔn)確性可以保持在Q45以上,在有些樣本上甚至已達(dá)到Q50(99.999%)水平(圖4),當(dāng)然加大測(cè)序深度也可以想要達(dá)到更高水平,測(cè)試結(jié)果中,最高已經(jīng)達(dá)到了Q52(99.9994%)。需要注意的是,這都是未經(jīng)過(guò)二代測(cè)序數(shù)據(jù)矯正的結(jié)果!

圖4 ?不同測(cè)序深度下R10 consensus序列準(zhǔn)確性比較
03、同聚物識(shí)別準(zhǔn)確性:

同聚物的識(shí)別準(zhǔn)確性是大家一直都比較關(guān)心的問題,從ONT官方釋放的測(cè)試結(jié)果顯示,相比于R9.4.1,R10版本芯片能夠顯著提高其在同聚物區(qū)域的堿基識(shí)別準(zhǔn)確度,并且?guī)缀醪粫?huì)引入缺失錯(cuò)誤(圖5)。

圖5 R10、R9.4.1芯片在同聚物區(qū)域的測(cè)序準(zhǔn)確度
04、數(shù)據(jù)錯(cuò)誤分布:

官方通過(guò)檢測(cè)同一樣本R10和R9.4.1中的錯(cuò)誤在基因組上的情況,發(fā)現(xiàn)R9.4.1與R10的錯(cuò)誤在基因組上分布并不是完全重疊的,通過(guò)兩種版本芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行混合分析,可極大地提高序列的準(zhǔn)確性(圖6)。這表明了,在不使用二代數(shù)據(jù)的前提下,后續(xù)也可考慮通過(guò)R10和R9.4.1數(shù)據(jù)組合的方式來(lái)提高結(jié)果的準(zhǔn)確度!

圖6?R10和R9.4.1錯(cuò)誤分布情況

小結(jié)

全新R10芯片在設(shè)計(jì)上采用了信號(hào)雙識(shí)別的策略,與R9.4.1芯片相比,有效提升原始序列,同聚物區(qū)域及Consensus序列準(zhǔn)確性。在不使用二代數(shù)據(jù)的情況下,結(jié)合R9.4.1及R10的數(shù)據(jù),可獲得更高的準(zhǔn)確性!目前R10芯片全球還處于小試研發(fā)階段,如果一切順利,三季度即可大規(guī)模商用,敬請(qǐng)期待!

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