隨著分子生物學的興起和向各方面的滲透，生物科學的各分支學科也經(jīng)歷著興衰更替的變化。從目前的發(fā)展狀況來看，在基因組研究中，利用常規(guī)研究技術及單一組學研究方法在沖擊文章的過程中，對于技術的新穎性及物種生物學問題挖掘的深入性還是有所欠缺的，因此在組學整合的前提下，可嘗試引用*新分子生物學研究技術，以為沖擊高分文章“添磚加瓦”。如下小編就通過一些文章案例為大家進一步介紹下在破譯某物種基因組密碼的基礎上，怎樣利用新興生物學研究技術，如基因編輯，單細胞測序技術及表觀遺傳學研究等對某物種生物學性狀進行深度挖掘。

01 基因編輯（CRISPR/Cas9）

基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種新興的相對√確的對某生物體基因組特定目標基因進行修飾的一種基因工程技術。其中CRISPR-Cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，也是用于基因編輯中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基礎的基因編輯技術在一系列基因治療的應用領域都展現(xiàn)出極大的應用前景，而在動植物研究中也初露鋒芒。

CRISPR-Cas9基因編輯技術原理圖

 

 

文中在對同源四倍體紫花苜蓿（Medicago sativa?L.）基因研究中，首先利用了70 GB，~22x PacBio CCS數(shù)據(jù)進行基因組組裝，組裝獲得紫花苜?；蚪M大小3154 Mb，Contig N50=459 kb, 然后利用ALLHiC進行同源染色體組群的劃分，最后通過Hi-C互作熱圖、遺傳圖譜共線性、ONT數(shù)據(jù)回比、BUSCO完整性、轉錄組對基因組完整性等進行評估。同源四倍體紫花苜?；蚪M的破譯對這一重要牧草后續(xù)的分子生物學研究具有重要意義。

 

圖1 ?紫花苜蓿基因組circos圖

 

圖2 紫花苜蓿Hi-C互作熱圖

進一步利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中PDS基因（八氫番茄紅素合酶基因）和PALM1基因（編碼Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor鋅指轉錄因子；在二倍體蒺藜苜蓿M. truncatula中，其對復合葉形態(tài)發(fā)生具有重要作用）進行改造，進一步確定不同單倍型變異對紫花苜蓿白化和矮化及葉復合形態(tài)表型性狀的影響。

圖3 CRISPR/Cas9介導的紫花苜蓿基因編輯研究

圖4 紫花苜蓿MsPALM1的基因編輯研究

 

文章中利用了基因組三代測序技術，獲得染色體級別的紫花苜?；蚪M的同時，攻克了同源多倍體物種基因組組裝難題，組裝獲得了4個單倍型紫花苜蓿基因組，為后續(xù)基因編輯研究做了重要的鋪墊，進而通過新技術CRISPR/Cas9基因編輯對控制相應表型性狀基因進行改造，對于紫花苜蓿后續(xù)分子生物學研究具有重要而深遠的意義。

 

02單細胞測序技術（10x Genomics）

單細胞測序，簡而言之，就是獲取單個細胞遺傳信息的測序技術，其中10 X Genomics單細胞轉錄組測序平臺具有廣泛的應用。該技術利用微流控、油滴包裹和barcode標記等技術來實現(xiàn)高通量的細胞捕獲技術，能夠一次性分離、并標記500–10000個單細胞，從而獲得每個細胞的3’端的轉錄組信息。主要用于細胞分型和標記因子的鑒定，從而實現(xiàn)對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測，此外該技術還可以預測細胞分化與研究發(fā)育軌跡，在當下疾病、免疫、腫瘤領域以及組織、器官、動植物發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

 

10x Genomics技術工作原理圖

 

 

文中首先利用三代利用~80×PacBio RS+~100×Hi-C輔助組裝等策略測序并拼裝了準染色體水平的高質量安德愛勝蚓基因組，組裝獲得基因組大小1.3 Gb（Scaffold N50≈111Mb），基因組完整性92.1%(BUSCO)，鑒定了31,817個蛋白編碼基因，同時發(fā)現(xiàn)，蚯蚓基因組中重復序列LINE2轉座元件可能在蚯蚓再生中扮演重要調控角色。

 

圖 5 蚯蚓基因組組裝

 

進一步利用10xGenomics單細胞轉錄組測序深度解析蚯蚓再生機制，蚯蚓再生早期72小時后損傷愈合部位細胞的高比例組分是干細胞，且多能干細胞在蚯蚓再生早期過程中具有重要作用。此項研究提供了一些蚯蚓再生的候選分子細胞學機制。

 

圖6?蚯蚓再生過程表型組分析

 

圖7?蚯蚓再生過程單細胞轉錄組研究

 

文章中利用了三代測序技術及Hi-C輔助基因組組裝技術，獲得染色體級別的蚯蚓基因組，基因組組裝連續(xù)性一般，但結合基因組序列信息及單細胞轉錄組研究解析了土壤生態(tài)系統(tǒng)重要成員無脊椎動物蚯蚓再生的分子細胞學機制，提出蚯蚓能夠作為研究再生生物學或者再生醫(yī)學的一個新的模型。

 

03表觀遺傳學研究

表觀遺傳學主要指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等，是研究在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達的可遺傳的變化的一門遺傳學分支學科。其中DNA甲基化作為重要的表觀修飾研究熱點，在動植物基因表達調控研究一直發(fā)揮著重要的作用，隨著三代測序技術的興起，DNA甲基化的研究也更加便捷，z確。

三代Nanopore DNA甲基化檢測原理（Michael C Schatz，et al. 2018.）

 

 

 

PacBio對粳稻Nip與秈稻93-11基因組更新：利用PacBio對Nip和93-11進行測序及Illumina平臺進行gap填充和誤差校正后，Nip基因組大小為380.7 Mb（contig N50=16.97 Mb），93-11基因組大小為396 Mb（contig N50=9.64 Mb）；進一步通過SMRT（單分子實時測序系統(tǒng)Single MoleculeReal Time）測序數(shù)據(jù)，在Nip和93-11中分別檢測出704875個和784912個6mA位點。

 

圖8 水稻中6mA甲基化分析

 

文章中進一步通過RNA-seq分析表明在Nip和93-11中，在6mA位點有大量的高表達基因甲基化，大量未甲基化基因在低水平表達。6mA甲基化基因的表達水平顯著高于非6mA基因；Nip對冷和鹽脅迫表現(xiàn)出更大的耐受性，而93-11對熱脅迫表現(xiàn)出更大的耐受性。6mA水平的變化在Nip和93-11之間表現(xiàn)出顯著的差異。水稻6mA含量與耐冷性呈負相關，與耐鹽性和耐熱性呈正相關。