研究背景

前列腺癌高度的瘤內(nèi)異質(zhì)性和復雜的細胞起源極大地限制了傳統(tǒng)的RNA測序在疾病診斷和分層中尋找更好的生物標志物方面的效用。基于組織標本的單細胞RNA測序在識別新的生物標志物方面具有很大的前景，但是這項技術(shù)還未被用于前列腺癌異質(zhì)性的研究。

實驗方法

采用單細胞RNA測序法鑒定細胞類型及相應的標記基因，通過拷貝數(shù)變異分析和偽混池測序的差異表達基因分析對不同聚類的惡性程度進行評價。通過標記基因的ROC曲線來評估前列腺癌的診斷和分層。免疫組化證實了標記基因的表達特征。

實驗結(jié)果

一、PCa的scRNA序列分析和細胞分型

兩名患者通過前列腺組織中AMACR的過度表達和TP63的缺失表達被診斷為PCa。收集兩名患者的癌樣，解剖并消化成單個細胞，用10×基因組學進行scRNA-seq（圖1a）。共有7904個合格細胞用于進一步分析。通過PCA對所有細胞進行無偏聚類，UMAP可視化細胞成分（圖1b）。通過DEG分析確定了15個主要簇的特征基因：T細胞、內(nèi)皮細胞、1型管腔細胞、2型管腔細胞、紅細胞、肌成纖維細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、3型管腔細胞、肥大細胞、基底細胞、成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、B細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞（圖1c）。

Fig1 通過單細胞測序鑒定PCa中不同的細胞類型。

在本文的數(shù)據(jù)中，根據(jù)管腔標志物在PCa樣本中的高表達水平，確定了3種類型的管腔細胞，包括角蛋白8（KRT8）和角蛋白18（KRT18）。為了表征這些管腔簇，作者用VlnPlot和FeaturePlot分別檢測了各自標記基因的表達模式。結(jié)果表明，這些溶解酶（k4a）可作為特異性的載體（k4a）表達于細胞內(nèi)（k4a4）。銅藍蛋白（CP）在2型管腔細胞中唯一表達，而細胞維甲酸結(jié)合蛋白2（CRABP2）在間充質(zhì)細胞以及2型和3型管腔細胞中高表達，這表明CP更適合2型管腔細胞（圖2a，b）。與其他簇相比，3型管腔細胞表現(xiàn)出更高水平的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（B4GALT1）和干擾素α誘導蛋白6（IFI6）的表達水平，表明B4GALT1和IFI6可以識別這些細胞（圖2a，b）。為了研究PCa組織中每種類型管腔細胞的細胞學定位，我們使用抗SLC45A3、抗CP、抗B4GALT1抗體進行免疫染色，并用DAPI復染組織切片（圖2c）。SLC45A3在前列腺組織的大多數(shù)管腔細胞中表達（圖2c）。相反，在一小部分管腔細胞中檢測到低表達水平的SLC45A3（圖2c）。不同類型的癌細胞在T1區(qū)的發(fā)育不完全相同（圖2 c）。

Fig2 應用scRNA-seq分析和免疫組化檢測PCa組織中不同管腔簇特異性標記基因的表達水平。

二、PCa中惡性管腔細胞的鑒定

為了評估已識別管腔簇的惡性程度，根據(jù)基因組間隔的平均表達模式對每種細胞類型的CNV水平進行分析。大多數(shù)非管腔細胞顯示極低的CNV水平，除了紅細胞和成纖維細胞，它們呈現(xiàn)中等CNV水平。

作者用edgeR軟件包進一步檢測了這些細胞的基因表達模式。1型管腔細胞顯示PCa標記物（包括FOLH1、KLK3和神經(jīng)肽Y（NPY）的表達水平更高。相反，2型管腔細胞表現(xiàn)出PCa抑制相關(guān)基因Latexin（LXN）和分泌性白細胞肽酶抑制劑（SLPI）的高表達，這些基因的缺失通常在PCa中檢測到，并且與PCa患者的陰性預后相關(guān)。然而，前向梯度2（AGR2）是PCa的尿標志物，也在2型管腔細胞中高表達，表明2型管腔細胞并非完全正常細胞。3型管腔細胞表現(xiàn)出C-C基序趨化因子配體3（CCL3）、C-X-C基序趨化因子配體1（CXCL1）和Dickkopf-WNT信號通路抑制物1（DKK1）的高表達，這些細胞在PCa中的表達水平增加，并與骨轉(zhuǎn)移和PCa的侵襲性有關(guān)。綜上所述，1型和3型管腔細胞簇是由在PCa發(fā)生和發(fā)展中起不同作用的惡性細胞組成，而2型管腔細胞則是正常的前列腺上皮細胞。

Fig3 每個管腔團簇的DEGs和富集過程

為了進一步確定每個管腔簇在PCa發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，作者進行了功能增強。1型管腔細胞上調(diào)的基因主要富集于參與癌癥進展的代謝過程，如脂肪酸代謝過程、甾體生物合成過程和肽類激素分泌，表明1型管腔細胞確實是惡性細胞（圖3a，d）。2型細胞中蛋白水解酶和胞漿蛋白水解活性均為陽性，提示細胞內(nèi)蛋白水解活性和2型細胞的高表達有關(guān)。有趣的是，2型管腔細胞中其他高表達的基因在正常前列腺發(fā)育過程中豐富，包括表皮發(fā)育、表皮細胞分化和對類固醇激素的反應（圖3b，e）。綜合起來，2型管腔細胞被鑒定為惡性程度相對較低的細胞。為了進一步驗證這一觀點，我們對從成對比較中獲得的每個亮度DEG進行GO分析，并得到類似的結(jié)果。在3型管腔細胞中表達的上調(diào)基因主要參與腫瘤遷移相關(guān)的過程，如血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的正調(diào)控和內(nèi)皮細胞的發(fā)育，表明3型管腔細胞也是惡性細胞（圖3c，f）。

三、PCa上皮細胞在腫瘤進展過程中的擬時間軌跡分析

PCa通常以管腔細胞擴張和基底細胞丟失為特征，因此認為管腔細胞是PCa中腫瘤細胞的起源。有研究證明來源可能并非來自管腔細胞，因為原發(fā)性良性前列腺組織的基底細胞可誘導免疫缺陷小鼠前列腺腫瘤的發(fā)生。為探討PCa腫瘤發(fā)生過程中腫瘤細胞的來源，采用擬時間軌跡分析法。

Fig4 利用基底細胞和管腔細胞重建癌細胞的假時間軌跡，并識別在該軌跡中變化的基因。

進一步用基底細胞和3種管腔細胞進行檢測?；准毎?型管腔細胞顯示在軌跡的開始（圖4a，b）。3型管腔細胞出現(xiàn)在軌跡分支1的末端，1型管腔細胞出現(xiàn)在軌跡分支2的兩端（圖4a，b）。這些結(jié)果表明基底細胞和2型管腔細胞都可能是PCa的始發(fā)細胞，并可能在PCa的發(fā)展過程中轉(zhuǎn)化為2種不同類型的惡性管腔細胞。

作者進一步分析了基因沿軌跡的動態(tài)表達變化，以確定PCa進展的關(guān)鍵基因。表達變化最顯著的基因包括：酸性磷酸酶、前列腺（ACPP）、激肽釋放酶相關(guān)肽酶2（KLK2）、KLK3、角蛋白15（KRT15）、基質(zhì)金屬肽酶7（MMP7）和NPY（圖4c）。此外，作者對前100個基因進行了擬時間表達模式的聚類分析，并分析了每個簇的功能豐富程度。聚類1中的基因高度表達于終末期，主要富集于PCa起始和進展相關(guān)的過程，包括細胞修飾的氨基酸代謝過程、激素分泌和AR信號通路（圖4d）。第二類基因在前列腺發(fā)育初期表現(xiàn)出高表達水平，主要參與表皮發(fā)育和表皮細胞分化，提示其在前列腺正常發(fā)育中的潛在作用（圖4d）。聚類3中的大多數(shù)基因在假時間軌跡的中間階段表達增加，并在細胞趨化性中富集（圖4d）。

四、PCa中惡性管腔細胞亞群的研究

作者首先分析來自TCGA的公共PCa患者中每個管腔標志基因的表達水平，以檢驗它們與PCa發(fā)生和發(fā)展的臨床相關(guān)性。相比之下，大多數(shù)1型管腔標記基因在惡性程度較低的前列腺癌中的表達高于惡性程度高或正常前列腺，這表明在前列腺癌的發(fā)生和早期發(fā)展中有潛在的作用（補充圖5）。因此，作者對1型管腔細胞進行了亞聚類，以確定引起PCa的亞群。PCA將1型管腔細胞分為5個亞組（圖5a，b）。分析每個亞組標記基因的功能富集，亞組1與腫瘤細胞有絲分裂準備所必需的生物分子代謝過程有關(guān)，如脂質(zhì)代謝過程和有機酸代謝過程（圖5c）。與其他亞組相比，亞組2與細胞運動、管形態(tài)發(fā)生和細胞死亡負調(diào)控有關(guān)，這些過程對腫瘤的遷移和生長至關(guān)重要（圖5c）。亞組3主要參與G蛋白偶聯(lián)受體信號通路和肌肉組織發(fā)育（圖5c）。第4亞組與PCa相關(guān)的過程，包括激素水平的調(diào)節(jié)，激素轉(zhuǎn)運和肽激素轉(zhuǎn)錄（圖5c）。相比之下，第5亞群的獨特功能主要集中在細胞生長（圖5c）。VlnPlot和特征圖顯示，AMACR、甘氨酸鈉基轉(zhuǎn)移酶樣1（GLYATL1）和PCA3在5亞組中特異表達（圖5d，e）。有趣的是，AMACR是一種在前列腺癌中高度表達的過氧化物酶體酶，參與支鏈脂肪酸和膽汁酸中間產(chǎn)物的β-氧化，對PCa的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。PCA3是一種非編碼RNA，在PCa細胞系、原發(fā)組織甚至PCa患者尿液中高表達。這兩個5亞組的標記物已經(jīng)被用于PCa的診斷和分層，這意味著5亞組可能是臨床上PCa診斷和分層所必需的一組不同的細胞。

Fig5 PCA對1型管腔細胞亞群進行亞群聚類。

五、Ⅰ型管腔細胞的5亞群是PCa診斷和分層的關(guān)鍵

分析TCGA患者Ⅰ型管腔亞群的臨床相關(guān)性及其標記基因的表達模式。正常前列腺中大多數(shù)1-4亞組標記基因的表達水平與PCa組織中的相似甚至更高。相比之下，第5亞組的標記基因在PCa組織中高表達，尤其是在Gleason評分為6或7的患者中，這表明在PCa的發(fā)生和早期發(fā)展中有潛在的作用（圖6a）。通過ROC分析，我們進一步鑒定了5亞組中6個特異性和敏感性最高的標記基因，包括AMACR、GLYATL1、HPN、前列腺癌基因PCA3，前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物18（PCAT18）和磷脂酶A2第七組（PLA2G7）（圖6b）?；?-基因集的ROC分析顯示了很強的PCa預測能力，AUC得分為0.937。此外，這些基因的表達模式不僅區(qū)分了PCa與正常前列腺，而且區(qū)分了早期PCa（Gleason評分=6）和高度惡性PCa（Gleason評分≥8）。許多PCa患者在1-2年內(nèi)表現(xiàn)出抗藥性，并復發(fā)為晚期PCa，如CRPC。第5亞組可能有助于PCa復發(fā)。然而，Kaplan-Meier分析顯示，這些基因在生化復發(fā)中沒有明顯的預測能力，無論是單獨的還是作為一個基因集（圖6c）?？傊?，第5亞組的惡性細胞是PCa診斷和分層的關(guān)鍵，但與生化復發(fā)無關(guān)。

Fig6 第5亞組與PCa診斷和分層的臨床相關(guān)性。

不同病理分級的癌組織之間（圖7a）。為了檢驗強度差異作者進一步用Hscore分析免疫染色評分，發(fā)現(xiàn)HPN在癌組織中的表達水平顯著增強（圖7b）。此外，高病理分級（Gleason評分=7,8,9）的腫瘤組織中HPN的表達水平顯著高于病理分級較低（Gleason評分=6）（圖7c）。因此，作者認為HPN可能是臨床PCa診斷和分層更為特異、敏感的生物標志物。為了探討HPN在預測PCa復發(fā)中的作用，作者根據(jù)HPN的表達水平將TCGA患者分為低和高兩組，然后分析了治療依從性標記物的表達，包括ATP結(jié)合盒亞家族G成員2（ABCG2）、醛脫氫酶1（ALDH1）、受體酪氨酸激酶（KIT）的表達，活化白細胞粘附分子。

Fig7 PCa組織陣列中HPN表達的驗證

結(jié)論

本文案例是第一個通過原發(fā)性PCa組織的scRNA序列檢測PCa異質(zhì)性的報告。PCa組織由3種不同類型的管腔細胞組成，它們在PCa的發(fā)生和發(fā)展中具有不同的作用。對PCa診斷和分層至關(guān)重要的管腔細胞亞群及其標記基因HPN被鑒定。這項研究結(jié)果不僅有助于目前對PCa發(fā)生和發(fā)展的理解，而且對PCa診斷和分層的標記物的鑒定應用具有潛在的價值。