考慮到較低的DSLNT與NEC相關(guān)而不受分泌狀態(tài)的影響，作者探討了HMO作為NEC發(fā)育的生物標(biāo)志物的用途。單因素ROC曲線(xiàn)分析表明，241nmol/ml是MOM中DSLNT鑒別NEC和對(duì)照嬰兒的最佳濃度（圖1C和D）。AUC值為0.947，靈敏度為0.9，特異性為0.9。

為了檢驗(yàn)整合額外的HMO是否可以提高分類(lèi)性能，利用增加的HMO數(shù)量建立了多變量ROC曲線(xiàn)。然而額外的HMO與DSLNT整合多變量模型中，與僅使用DSLNT的單變量模型相比性能相似。

圖1 NEC和CTRL組HMO圖譜和DSLNT濃度分析

2、按NEC類(lèi)型分層的HMO圖譜分析

作者比較了未接受手術(shù)的NEC-M和接受手術(shù)的NEC-S。NEC-M和NEC-S聚類(lèi)到一起與對(duì)照組分離（圖2A）。兩種HMOs顯著不同，與對(duì)照組相比NEC-M和NEC-S組的DSLNT均較低（圖2B）。此外，與NEC-M組和健康對(duì)照組相比NEC-S組MOM中LNnT顯著降低（圖2C）。

作者隨后通過(guò)調(diào)整線(xiàn)性模型研究了DSLNT和LNnT濃度與臨床變量之間的潛在關(guān)聯(lián)。DSLNT與兩種疾病類(lèi)型呈負(fù)相關(guān)，NEC-M的系數(shù)值為-0.60，NEC-S的系數(shù)值為-0.67（圖2D）。然而根據(jù)調(diào)整后的線(xiàn)性模型LNnT與疾病類(lèi)型無(wú)關(guān)。分泌型母親中DSLNT和LNnT均顯著較高。母親的DSLNT與胎齡呈正相關(guān)，與出生體重呈負(fù)相關(guān)。HMO與母親性別、分娩方式、胎齡和DOL均無(wú)相關(guān)性（圖2D）。

圖2 NEC-M和NEC-S分層的HMO圖譜分析

3、嬰兒腸道微生物組與NEC發(fā)育的關(guān)系

作者納入了含有HMO數(shù)據(jù)的嬰兒的糞便微生物組數(shù)據(jù)，進(jìn)行獨(dú)立研究獲得宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。14例NEC患兒和34例對(duì)照組的644個(gè)糞便樣本。NEC患兒物種豐富度顯著降低，shannon指數(shù)差異不顯著（圖3A）。PCoA分析顯示NEC和對(duì)照之間細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異不大（圖3B）。門(mén)水平分析顯示，相比于對(duì)照組NEC患兒Actinobacteria 相對(duì)豐度顯著降低，Proteobacteria 相對(duì)豐度顯著升高（圖3C）。種水平分析相比于對(duì)照組NEC患兒B. longum相對(duì)豐度降低，Enterobacter cloacae相對(duì)豐度升高（圖3D）。

圖3?NEC和對(duì)照組早產(chǎn)兒糞便宏基因組分析

4、HMO和細(xì)菌圖譜的綜合分析

采用種水平數(shù)據(jù)對(duì)PGCTs進(jìn)行DMM聚類(lèi)，5種PCGTs最理想（圖4A）。PGCT-1特征菌是高豐度Staphylococcus?spp和Enterococcus faecalis，PGCT-2高豐度Escherichia?spp，PGCT-3高豐度Klebsiella?spp，PGCT-4和PGCT-5高豐度Bifidobacterium?spp，B. breve在PGCT-5豐度高。根據(jù)樣本在所有時(shí)間點(diǎn)和clusters上的分布，在出生后前70天內(nèi)接受MOM中DSLNT高于和低于241nmol/ml的嬰兒微生物組差異顯著（圖4B）。在校正組間抽樣頻率不均勻后，最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)接受MOM超過(guò)DSLNT閾值2倍的嬰兒類(lèi)似于PGCT-5，其Bifidobacterium高豐度（圖4A）。

圖4母乳喂養(yǎng)高于或低于241nmol/ml DSLNT的嬰兒PGCTs分析

5、HMO和宏基因組數(shù)據(jù)可釋方差和隨機(jī)森林分類(lèi)

使用橫斷面HMO和橫斷面宏基因組數(shù)據(jù)集，作者試圖確定哪些臨床因素與HMO和細(xì)菌圖譜最相關(guān)（圖5A）。分泌狀態(tài)可以解釋HMO 56%的變異，其他協(xié)變量與HMO無(wú)顯著相關(guān)性。細(xì)菌圖譜與胎齡、DOL、抗生素使用和益生菌服用顯著相關(guān)，而與母親的分泌狀態(tài)相關(guān)性不顯著?？傊@些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了HMO和細(xì)菌分布受多種非重疊因素影響。

作者比較了基于HMO數(shù)據(jù)集、宏基因組數(shù)據(jù)和兩個(gè)數(shù)據(jù)集結(jié)合建立的區(qū)分嬰兒NEC和健康的隨機(jī)森林模型的性能，鑒于所有這些信息在疾病發(fā)病前就可以獲得，因此在臨床實(shí)踐中可作為風(fēng)險(xiǎn)分類(lèi)系統(tǒng)。在組合模型中，DSLNT在對(duì)照組富集，DSLNH和Escherichiaunclassified的相對(duì)豐度在NEC中高（圖5B）。

圖5使用Adonis和random forest建立HMO和嬰兒糞便宏基因組模型