近日，河南農業(yè)大學范國強教授團隊在國際期刊《Molecular Plant》（IF：13.162）上發(fā)表了題為?“Genomic insights into the fast growth of paulownias and the formation of Paulownia witches’ broom”的研究論文。百邁客生物科技作為共同一作共同參與研究。本研究通過三代PacBio等技術繪制白花泡桐基因組精細圖及泡桐叢枝植原體基因組完成圖，并揭示了白花泡桐速生的關鍵因素，以及泡桐叢枝病發(fā)生的分子機制。

研究背景

泡桐（2n=2x=40）是我國重要的速生用材樹種之一，在保障我國木材安全、改善生態(tài)環(huán)境和提高人民生活水平等方面具有重要作用。然而，泡桐的利用和研究還很薄弱。泡桐叢枝(Paulownia witches’ broom；PaWB)植原體是一種專性寄生病原菌，是泡桐屬植物的一種常見病害。植原體感染的泡桐，通常表現(xiàn)出葉片泛黃、植株生長遲緩以及叢枝等典型癥狀。泡桐及其植原體基因組信息的缺乏嚴重阻礙了PaWB病理生物學的闡明。因此，解析其對應參考基因組信息將有助于闡明叢枝病的發(fā)病機制。

材料與方法

Denovo：

1、白花泡桐（Paulownia fortunei）葉片；89X Illumina+ 87.3X PacBio+ 90X Hi-C

2、PaWB侵染的百花泡桐幼苗（PFI）的莖進行DNA分離和PacBio測序，選取無法比對到宿主基因組的Reads用于組裝（泡桐叢枝植原體基因組）

RNA-seq：

1、4年生白花泡桐和毛泡桐樹的葉片、樹干形成層和樹干韌皮部組織，每個三生物學重復。

2、健康幼苗、患病幼苗、MMS或RIF處理5天、20天等天數(shù)的患病幼苗頂芽，每個三生物學重復。

主要研究內容

1、白花泡桐基因組組裝注釋

2、白花泡桐系統(tǒng)進化與全基因組復制

3、白花泡桐形態(tài)發(fā)生相關基因家族

4、C₃光合作用與景天酸代謝（CAM）相結合提高白花泡桐的光合效率

5、與泡桐植原體侵染相關的泡桐基因網絡模塊

6、PaWB植原體基因組特征及比較基因組分析

7、PaWB-SAP54是PaWB植原體的功能效應子

8、PaWB-SAP54通過介導PfSPLa泛素化誘導PaWB的形成

主要研究結果

1. 白花泡桐基因組組裝注釋

本次研究的白花泡桐擁有2.03%的高度雜合，以及50%的重復序列；作者通過三代長讀長等測序技術，最終組裝完成511.6 Mb泡桐基因組（流式預估528.24 Mb，survey 552 Mb），contigN50=852.4 Kb；并通過Hi-C技術將93.2%序列錨定至20條假染色體上。通過BUSCO評估（97.45%）、轉錄組回比評估（96.02%）、Hi-C熱圖評估等結果表明本次構建了高質量染色體水平的白花泡桐基因組。

共預測31,985個蛋白編碼基因，重復元件（257.65 Mb）占基因組的50.34%，以Ty3/gypsy和Ty1/copia的長末端重復反轉錄轉座子（LTR-RTs）為主，分別占基因組的15.96%和13.54%。重復序列動態(tài)分析表明，在過去的800萬年中，泡桐沒有發(fā)生LTR-RT的爆發(fā)事件。轉座子（Transposable elements，TEs）在基因組中分布不均，通常傾向于在著絲粒區(qū)積累。對于17、18號染色體，TEs在一端聚集，形成端著絲粒染色體（圖1A），這與先前基于核型分析的研究結果一致。

2. 白花泡桐系統(tǒng)進化與全基因組復制

為了進一步明確泡桐的系統(tǒng)進化關系，通過與透骨草科、列當科、茄科、茜草科以及葡萄科中9個近緣材料進行比較基因組分析。結果表明，泡桐科在40.92百萬年時從透骨草科和列當科最近的共同祖先分化而來。在泡桐的多拷貝基因家族中，有3022個家族發(fā)生了擴張或收縮，而擴張的基因家族涉及與木質素和纖維素合成（UDP- forming）相關的基因家族。

Ks及共線性等分析表明，白花泡桐與溝酸漿（Mimulus guttatus）及芝麻（Sesamum indicum）一致，都發(fā)生過兩輪全基因組復制事件。第一輪為共有的γ三倍化事件（約122~164mya的WGT-γ），第二輪為泡桐與芝麻共有的近期二倍化事件。

染色體重建表明，Chr7和Chr11是在最近的WGD之后從染色體融合中衍生出來的，因為Chr17、Chr15和Chr19分別只與葡萄Chr1、Chr18和Chr5保持了祖先的共線性（圖1F）。多對泡桐染色體表現(xiàn)出相同的融合模式，表明染色體融合發(fā)生在最近的WGD之前：Chr8和Chr14均起源于祖先葡萄Chr9和Chr17的融合，而Chr9和Chr16均起源于祖先葡萄Chr10、Chr12和Chr19的融合。功能富集分析表明，新WGD的基因富集于“鎘離子反應”和“細菌防御”，串聯(lián)重復的基因富集于“生物刺激反應”和“防御反應”。這些觀察結果暗示了基因組/基因復制在泡桐適應環(huán)境變化中的重要作用。

3. 白花泡桐形態(tài)發(fā)生相關基因家族

植物的形態(tài)發(fā)生和生長速率可能歸因于細胞增殖和分裂、細胞壁形成以及光合效率或其他生物過程的增強。細胞分裂素生物合成中的四個基因家族和細胞周期調控中的十個基因家族，通過串聯(lián)基因復制或最近的WGD發(fā)生顯著擴增（圖2A）。在泡桐屬植物中，白花泡桐（PF）的生長速度遠遠快于毛泡桐（P. tomentosa，?PT）。約85%的毛泡桐基因cDNA可定位于白花泡桐基因組，因此對白花泡桐和毛泡桐的葉片、樹干韌皮部和樹干形成層進行了比較轉錄組學分析。WGCNA分析得到12個潛在快速生長相關ME（FME1~12），F(xiàn)ME3與毛泡桐和白花泡桐形成層的生長發(fā)育相關（圖2B）。FME3模塊包括42個參與植物激素途徑或參與細胞周期調控的基因。FME4僅在白花泡桐中與形成層生長和發(fā)育高度相關（圖2B），這個模塊中有五個基因與激素信號有關，其中包括參與細胞分裂素代謝的腺苷激酶1，且這些基因在白花泡桐中顯著擴增。通過基因的表達及拷貝數(shù)分析表明，CESAs、Csls和木質素生物合成基因可能在白花泡桐的發(fā)生中起作用（圖2D）。

4. C₃光合作用與景天酸代謝（CAM）相結合提高白花泡桐的光合效率

較高的光合效率有助于白花泡桐的快速生長。在隨機選擇的C₃植物中，白花泡桐的凈光合速率最高且與C₄植物非常接近。通過Drop-seq分析白花泡桐葉肉細胞的轉錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)參與卡爾文循環(huán)的基因表達水平較高，表明卡爾文循環(huán)非?；钴S。此外，白花泡桐葉片的碳同位素（δ13C）變化率晝夜差異不顯著。這些觀察結果為白花泡桐中典型的C₃碳同化提供了有力的證據(jù)。

作者測試了白花泡桐是否通過CAM來固定CO₂（CAM可以通過補充C₃光合作用來提高光合速率）。發(fā)現(xiàn)白花泡桐葉片氣孔在白天和晚上均開放（圖3A），夜間氣孔開放表明CAM通路可能參與了泡桐的二氧化碳固定。較高的CAM途徑關鍵基因拷貝數(shù)為泡桐中更復雜的光合類型奠定了基礎。

為了確定CAM通路關鍵基因的表達模式，作者使用上午9:00和晚上9:00采集的白花泡桐葉片進行轉錄組學分析。結果表明白花泡桐通過在夜間補充CAM途徑獲得更高的光合能力，從而有助于泡桐的快速生長（圖3D、3E）。

5. 與泡桐植原體侵染相關的泡桐基因網絡模塊

PaWB植原體感染是泡桐死亡的主要原因之一。作者采用不同濃度的甲磺酸甲酯（MMS）和利福平（RIF）處理PaWB植原體感染的白花泡桐苗（PFI）。對MMS和RIF處理不同時間的患病泡桐幼苗進行RNA-seq分析，研究泡桐對PaWB植原體侵染的響應。WGCNA分析鑒定出27個不同的PaWB相關模塊特征基因（PME1~27）（圖4A）。這些模塊包含參與光合作用、細胞運輸和離子穩(wěn)態(tài)、植物生長發(fā)育、防御、以及轉錄有關的hub基因（圖4B ，4C）。

6. PaWB植原體基因組特征及比較基因組分析

為了進一步了解植原體與泡桐相互作用的分子機制，作者對PaWB植原體基因組進行了測序和組裝。組裝的叢枝植原體核基因組大小為891,641 bp，有1,147個開放閱讀框、32個tRNAs和4個可移動元件（PMUs），PMUs在植原體基因組的重組和植原體在宿主體內的適應性中起著重要的作用。

與另外七個植原體基因組進行比較（來自基于16srRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹中的I、V、X和XII分支）。通過單拷貝核心基因構建進化樹，發(fā)現(xiàn)進化關系與16srRNA的結果基本一致， PaWB植原體與洋蔥黃化植原體（OY-M）的關系更為密切（圖5C）。隨著系統(tǒng)發(fā)育距離的增加，PaWB植原體與其他植原體之間的基因組同源性大大降低，表明基因組重排的頻率很高。

為了深入了解對植原體感染非常重要的代謝途徑的差異，作者分析了甘油磷脂、糖酵解、嘧啶和葉酸代謝中基因的存在和缺失。只有PaWB植原體和OY-M具有完整的葉酸生物合成途徑，而其他植原體缺乏這四個基因的部分或全部。

7. PaWB-SAP54是PaWB植原體的功能效應子

泡桐叢枝植原體含有73個效應因子，其中11個效應因子可能與叢枝病的發(fā)生密切相關。為了研究PaWB-SAP54在PaWB植原體侵染過程中的作用，作者利用根癌農桿菌將PaWB-SAP54基因導入毛果楊。與野生型相比，轉基因毛果楊表現(xiàn)出分枝增多，且PaWB-SAP54的轉錄水平增加了4.7-5.3倍（圖6A）。轉基因毛果楊在較細的莖上有二級分枝，而在野生型中沒有觀察到分枝（圖6B）。表明PaWB-SAP54介導了叢枝癥狀的形成。

8. PaWB-SAP54通過介導PfSPLa泛素化誘導PaWB的形成

為了探討PaWB-SAP54在PaWB形成過程中的分子機制，作者采用酵母雙雜交（Y2H）技術篩選了PaWB-SAP54蛋白的潛在結合蛋白。共發(fā)現(xiàn)112個泡桐蛋白與PaWB-SAP54相互作用，其中鑒定出的鱗狀啟動子結合蛋白a（PfSPLa）（圖6C）是AtSPL9和AtSPL15的同源物，這兩種蛋白都對腋芽的形成和分枝發(fā)育有負調控作用。在PaWB植原體感染的幼苗中，PfSPLa的蛋白質豐度顯著降低（圖6D）。由于泛素化參與了叢枝病的形成，因此作者研究了PfSPLa是否直接受泛素降解途徑的調控。用26S蛋白酶體抑制劑環(huán)氧霉素處理感染的幼苗后，PfSPLa的表達增加（圖6D），并通過westernblot分析直接證實PfSPLa的泛素化（圖6E）。以PfSPLa蛋白為誘餌的Y2H篩選表明，PfSPLa可直接與多聚泛素和26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基3（PfRPN3）相互作用（圖6F）。雙分子熒光互補和免疫共沉淀結果，進一步證實這種相互作用。用PfSPLa-RNAi構建轉基因毛果楊，發(fā)現(xiàn)3個與PfSPLa同源的基因表達下調，也引起毛果楊分枝表型的發(fā)生（圖6G-6I）。并且RNAi植物表現(xiàn)出矮化表型（圖6H）。這些結果表明，PaWB-SAP54可能與PfSPLa相互作用，進而以泛素/26S蛋白酶體依賴的方式促進PfSPLa的降解，最終誘發(fā)泡桐叢枝病。

植物激素的定量顯示，轉基因植株中赤霉素、生長素和細胞分裂素含量有顯著變化（圖6J）。結果表明，PfSPLa通過控制激素水平來調節(jié)分枝的形成。

小結

本研究通過白花泡桐及其叢枝植原體基因組測序和進化分析，揭示了C₃光合作用與景天酸代謝相結合提高光合效率的方式，是白花泡桐快速生長的關鍵因素。并通過WGCNA、轉基因、酵母雙雜交、雙分子熒光互補和免疫共沉淀等方式，闡明了泡桐叢枝植原體效應因子PaWB-SAP54介導的PfSPLa泛素化引起了泡桐叢枝病的形成。該研究為加速泡桐的分子育種、品種改良及進一步闡明泡桐叢枝病發(fā)生分子機制奠定了堅實基礎。