心臟是第一個發(fā)育完整的功能器官，對胚胎發(fā)育至關(guān)重要。心臟發(fā)生涉及來自多個譜系的異質(zhì)性細胞群，它們在時空上相互作用，以驅(qū)動心臟的發(fā)育。心臟發(fā)育過程中細胞類型的異質(zhì)性使得利用傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)技術(shù)研究心臟變得困難。雖然單細胞RNA測序(scRNA-seq)已被用于研究心臟發(fā)育中涉及的細胞機制，但是它不能保存空間信息，也不能研究細胞分化和形態(tài)發(fā)生之間復(fù)雜的相互作用。在這里，作者結(jié)合空間和高通量單細胞數(shù)據(jù)來研究雞胚胎心臟發(fā)育的時空相互作用和調(diào)控機制。百邁客不僅提供單細胞系列產(chǎn)品，6大核心產(chǎn)品，單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細胞免疫組庫、單細胞ATAC-seq、單細胞核轉(zhuǎn)錄組、單細胞全長轉(zhuǎn)錄組，而且實現(xiàn)了單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組百邁客云端APP分析，深入大數(shù)據(jù)挖掘，一鍵快速分析，單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析近似實現(xiàn)單細胞分辨率的空間異質(zhì)性，助您進入時空組學(xué)研究新時代。接下來我們來看看作者如何實現(xiàn)單細胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合研究雞的心臟發(fā)育過程。
英文題目：Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis
中文題目：時空單細胞RNA測序確定了雞心臟發(fā)育過程中細胞分化和形態(tài)發(fā)生之間的相互作用
期刊名稱：Nature Communications
影響因子：14.919
原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7979764/
4個階段的雞卵；scRNA-seq；stRNA-seq；smFISH；Immunohistochemistry
結(jié)果
1、胚胎雞心臟發(fā)育的空間解析單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)調(diào)查
? ? ? ? 為了研究心臟發(fā)育過程中分化和形態(tài)發(fā)生之間復(fù)雜的相互作用，作者結(jié)合了單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，分析了雞心臟Hamburger-Hamilton心室發(fā)育的四個關(guān)鍵階段。最終生成了22315個細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和覆蓋6800多個spots的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。
? ? ? ? 通過對單細胞數(shù)據(jù)進行降維、聚類及可視化分析，最終確定了15個不同的心肌細胞類型簇。除了心肌細胞類型，作者還檢測到少量的紅細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，并發(fā)現(xiàn)了一個獨特的異質(zhì)性細胞群，該細胞能高水平表達beta-4 (TMSB4X)。對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獨立分析確定了具有差異轉(zhuǎn)錄程序的解剖區(qū)域。將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與單細胞數(shù)據(jù)進行整合，作者構(gòu)建了所有心肌細胞類型對的接近圖，并將其可視化為弦圖(圖1e)。研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞在第7天與心內(nèi)膜細胞共定位，在第10天和第14天與血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞共定位，這是可預(yù)料的，因為在第7天，心內(nèi)膜細胞排列在小梁狀心肌中，而在第10天，血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞出現(xiàn)在致密心肌中。??
? ? ? ? 作者收集并重組了來自心外膜、心內(nèi)膜和心肌譜系的單細胞轉(zhuǎn)錄組，然后重建譜系分化軌跡。通過對上皮細胞(TCF21+?，WT1+， TEK?)、間充質(zhì)細胞(TCF21+?，TEK?)、成纖維細胞(TCF21+?，POSTN+?，TEK?)和壁細胞進行心外膜譜系分析，發(fā)現(xiàn)了一個豐富的時空分化過程。對來自心室游離壁的5621個心外膜細胞簇進行分析，識別出五個主要細胞簇:一個早期心外膜祖細胞簇(C1)，兩個中間前體細胞簇(C2和C3)，一個成纖維細胞簇(C4)和一個壁細胞簇(C5)。
? ? ? ? 其中，細胞集群C1主要是來源于HH24(第四天)心室和心外膜祖細胞，并發(fā)現(xiàn)了與心外膜發(fā)育相關(guān)的維甲酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生長因子MDK。細胞簇(C2和C3) 主要出現(xiàn)在EMT的HH31(第7天)階段。C2簇表達于胚胎心臟最外層的心外膜，主要為TCF21+、WT1+、TBX18+，并使MDK表達上調(diào)。C3細胞群以TBX18?和WT1?為主，高水平的表達了與細胞遷移有關(guān)的細胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，上調(diào)了EMT調(diào)節(jié)因子SNAI1的表達。將細胞類型標記轉(zhuǎn)移到空間數(shù)據(jù)表明，在第7天和第10天心臟分期中，只有上皮細胞(心外膜亞簇C1和C2)在空間上局限于心室壁最外層的心外膜層。然而，在第7天，表間質(zhì)(心外膜C3亞簇)在空間上并不局限于心外膜外層，這表明它們駐留在心肌而不是心外膜外層。??
到第10天(HH36)時，成纖維細胞(C4)表達COL3A1和DCN，壁細胞(C5)表達ACTA2、MYH11、TAGLN和RGS5。然而，此時心外膜最外層的一些細胞仍然保持中間未分化表型。到第14天(HH40)時，大多數(shù)心外膜層細胞已分化為成纖維細胞，這是由其定位到第14天心外膜所提示的，而其他成纖維細胞和壁細胞如預(yù)期的一樣定位于整個心肌。軌跡重建證實了第7天的分支細胞發(fā)育以及第10天的分支合并和分化(圖2c)。在第7天和第10天發(fā)現(xiàn)了顯著的分期變異性，在心外膜內(nèi)層存在未分化細胞，而在心肌中存在分化細胞(圖2d)。
? ? ? ?為了支持心外膜譜系的結(jié)果，作者在第7天(HH31)心臟切片上進行了smFISH實驗。smFISH的結(jié)果驗證了scRNA-seq和空間RNA-seq的結(jié)果，并與這些細胞群來自心外膜譜系的可能性的結(jié)果相一致。???
3、時空上解決了心臟組織發(fā)育過程中局部細胞異質(zhì)性
? ? ? ? ?為了研究胚胎心室的空間轉(zhuǎn)錄差異，作者對空間數(shù)據(jù)進行了聚類，并根據(jù)其在組織中的位置對聚類進行解剖區(qū)域標記。?通過分析，作者識別出心室、心房、瓣膜和流出道的不同空間簇，也識別出心室區(qū)域的不同層，包括心外膜、心肌致密區(qū)、小梁區(qū)以及心內(nèi)膜。
? ? ? ? ?為了檢測區(qū)域特異性標記，作者在各個階段對解剖區(qū)域進行了差異基因表達分析。在第7天和第10天發(fā)現(xiàn)了左右心室的轉(zhuǎn)錄差異。這些差異在第14?天心臟發(fā)育完成時減小。與右側(cè)相比，左心室中TBX5的表達顯著富集，并且這種差異隨著第7天至第14天的分期而降低（圖3d）。從第7天開始，CHGB的表達主要局限于右心室，ACTG2在第7天表達于右心室（圖3f和3g）。TBX5明確了左右心室腔室的位置，并已被證明在發(fā)育中的雞的左心室中富集。Takeuchi等人的報道的在右心室特異性表達的TBX20，在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中并沒有得到證實（圖3e）。從第7天到第14天的scRNA-seq數(shù)據(jù)集沒有捕捉到TBX5、?ACTG2和CHGB在心室中表達的顯著差異，盡管它們似乎確實傾向于在其擬心室的的細胞中高表達。?smFISH證實了TBX5在左心室小梁心肌細胞中上調(diào)，并這種富集隨著發(fā)育階段而減少（圖3i）。smFISH實驗也進一步證實了?TBX20在不同階段的左、右心室的表達水平非常低（圖3i）。同時還發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白（MB）的表達在空間上局限于后期發(fā)展的致密心肌層，這表明心肌細胞向更成熟的表型轉(zhuǎn)化，需要更大的氧氣（圖3h）?？紤]局部細胞類型組成，發(fā)現(xiàn)MB的上調(diào)是由于不成熟肌細胞增加和肌細胞疏松心肌中MB表達增加的結(jié)果造成的（圖3b）。相反，NPPB基因在空間上局限于形成小梁狀心肌層，如預(yù)期的一樣。作者進一步探索了空間數(shù)據(jù)集，以確定先天性心臟缺陷（CHD）相關(guān)基因表達的時空模式。在50多個人類基因中，顯性功能的突變喪失已被發(fā)現(xiàn)與冠心病有關(guān)。這些基因在發(fā)育過程中，通過以高度特定的時空模式表達調(diào)控水平來預(yù)測在冠心病中，基因型和表型之間可能存在很強的相關(guān)性。對CHD相關(guān)基因進行了空間RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如GATA5的表達在瓣膜區(qū)域富集，IRX4的表達局限于心室組織，TBX5在左心室富集（圖4a-b和圖3d）。PITX2基因是早期中胚層的主要調(diào)控因子，也是決定器官的關(guān)鍵成分，在心臟左側(cè)富集（圖4c）。冠心病相關(guān)肌體蛋白編碼基因如ACTC1和GJA5在心房和心室組織中表達豐富，而MYH7僅局限于心房（圖4d-f）。?
4.?胸腺素beta-4在冠狀血管細胞中持續(xù)富集
? ? ? ? 通過對scRNA-seq聚類分析，鑒定出一個富含TMSB4X的異質(zhì)性細胞簇，包含來自所有四個發(fā)育階段的細胞（圖1b）。TMSB4X編碼beta-4，這是一種眾所周知的多效性分泌小肽，在肌動蛋白-細胞骨架組織、細胞運動、存活和分化中起著重要作用。為了深入研究了TMSB4X細胞表型的異質(zhì)性及其轉(zhuǎn)錄譜，作者將1075個TMSB4X細胞重新聚類，并檢查其細胞類型組成（圖5a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)簇1主要由表達TCF21?的心外膜細胞和表達心內(nèi)膜標記物的IRX6和NPC2的心內(nèi)膜細胞組成（圖5a，右）。簇2主要由差異表達的ACTA2的血管壁細胞組成（圖5a，右）。簇3主要由差異性表達FABP5和?TM4SF18的冠狀血管內(nèi)皮細胞組成（圖5a，右）。stRNA-seq數(shù)據(jù)表明，在后期階段，TMSB4X在瓣膜和心室壁中富集。對scRNA-seq數(shù)據(jù)的進一步分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育階段，beta-4表達略有增加，在冠狀血管內(nèi)皮細胞亞簇2中beta-4表達最高。差異基因表達分析發(fā)現(xiàn)，與細胞骨架組織相關(guān)的基因?VIM、RHOA、ACTB、?ACTG1和DSTN?顯著上調(diào)（圖5b）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了被beta-4激活的鈣結(jié)合蛋白CALM1和?CALM2的上調(diào)，兩種蛋白與細胞周期進展、增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)?？偟膩碚f，TMSB4X可以增強細胞骨架組織活性和鈣信號。
? ? ? ? 為了進一步確定beta-4的具體類型，作者進行了smFISH?和免疫組化實驗。結(jié)果表明，在第4?天 （?HH24）時，beta-4 mRNA在心外膜和心內(nèi)膜中表達最高。在第7天（?HH31）時，beta-4 mRNA在冠狀血管內(nèi)皮細胞中的表達最高。在第10天（HH36）時，beta -4?在?CDH5+?血管內(nèi)皮細胞和周圍的壁細胞（CDH5-，PDGFRB+）中表達最高。在第14天（HH40）時，?TMSB4X?在?CDH5+?血管內(nèi)皮細胞中表達仍然較高，而在?PDGFRB+ CDH5-壁細胞中表達較低。免疫組化進一步證實了這些發(fā)現(xiàn)?？傊?，結(jié)合空間分辨率的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和影像學(xué)數(shù)據(jù)顯示，TMSB4X?在所有細胞類型中普遍表達，但在冠狀動脈細胞中富集，從冠狀動脈血管發(fā)育的開始，到心室發(fā)育過程中冠狀動脈血管的成熟。
? ? ? ? 作者將單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合起來，以高時空分辨率探索了雞心臟的早期發(fā)育階段，構(gòu)建了一個具有單細胞和空間分辨率的基因表達譜系，揭示了幾種調(diào)控機制，并證明了scRNA-seq和stRNA-seq可以用于研究細胞分化和形態(tài)發(fā)生之間的相互作用，實現(xiàn)高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組研究空間基因表達異質(zhì)性，甚至空間細胞異質(zhì)性，單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)將會在更多的領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的應(yīng)用。
參考文獻
Mantri M, Scuderi GJ, Abedini-Nassab R,?et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 2021 Mar 19;12(1):1771.
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https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33741943
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