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基因克隆(Gene cloning)是分子生物學(xué)中經(jīng)典的獲取目的基因片段的技術(shù),單克隆陽性率是判定實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,百邁客的無縫克隆試劑盒可以在一小時(shí)內(nèi)完成定向克隆。詳情咨詢當(dāng)?shù)劁N售或者后臺留言,我們會有專門的工作人員回復(fù)~~1.基因克?。℅ene cloning) 一套完整的流程:

PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增目的片段→電泳(electrophoresis)→純化(purification)→連接 (ligase )→轉(zhuǎn)化(transformation)→陽性克隆(positive clone)→檢測(detection)

圖1:無縫克隆流程圖(圖片來源于網(wǎng)絡(luò))

2. PCR擴(kuò)增:選擇要擴(kuò)增的目的片段,在正義鏈和反義鏈的末端分別設(shè)計(jì)一條帶有線性化載體正義鏈和反義鏈部分同源序列一致的引物,此處參考說明書建議(15-25bp)。為了減少非特異性擴(kuò)增,建議與靶序列的匹配度越高越好。

3.電泳:PCR結(jié)果的好壞通常通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察條帶有無或者濃度大小,基本原理是瓊脂糖凝膠介質(zhì)中添加了在紫外下可以顯色的EB, 這種試劑可以嵌合到核酸分子中,與DNA雙鏈結(jié)合,因此,分子量越大的DNA分子,顯色度越高,在相同濃度下也越亮。有的時(shí)候如果分子量很小的DNA, 濃度又不高的情況下,DNA條帶有可能會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

4.目的片段的純化(膠回收):PCR擴(kuò)增結(jié)束后,體系中可能會有未參與反應(yīng)的聚合酶,Mg2+等,所以一般是建議通過純化的步驟將這些雜質(zhì)去除,以利于后續(xù)反應(yīng)的穩(wěn)定進(jìn)行。

載體線性化:目的片段插入需要將環(huán)狀的質(zhì)粒用酶來消化成線性的雙鏈DNA分子,實(shí)際情況下載體消化會因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間和酶量多少而有較大區(qū)別,如果用于后續(xù)的基因克隆,建議消化盡量完全。

5.連接反應(yīng):Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix試劑盒可以將多個(gè)片段組合到載體上,形成一個(gè)環(huán)狀的重組質(zhì)粒。用于后續(xù)的建庫測序或者誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

6.轉(zhuǎn)化:基本原理是質(zhì)粒容易在大腸桿菌中穩(wěn)定繁殖,這部分是基因克隆的關(guān)鍵,如果成功,后續(xù)的平板上會有單克隆的出現(xiàn)。有單克隆出現(xiàn)可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。單克隆平板可以在4 ℃冰箱存放一個(gè)月,仍然不失效。

7.檢測:挑取帶有抗生素平板單克隆擴(kuò)大培養(yǎng),3-4 h, 使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加,隨后用于菌落PCR檢測,是否是插入了目標(biāo)片段的質(zhì)粒。

小貼士

其他判斷陽性單克隆的方法?

最可靠的方法是酶切,一個(gè)環(huán)狀重組質(zhì)粒,在對應(yīng)的位置用限制性內(nèi)切酶雙酶切后,會出現(xiàn)兩個(gè)目的片段,如果不能出現(xiàn)兩個(gè)片段,一般可以認(rèn)為是空載體沒有線性消化完全。

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結(jié)果展示

圖2:單克隆檢測示意圖

結(jié)果分析

攜帶有目的片段的質(zhì)粒能夠抵抗抗生素,才使得在平板培養(yǎng)基上長出來。但也有可能是沒有消化完全的空質(zhì)粒。因此,下一步的鑒定實(shí)驗(yàn)顯得尤為重要。菌落PCR在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,容易有假陽性出現(xiàn),可能的原因很多,因此,最根本的方法就是提高陽性率。以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增,產(chǎn)物濃度會很高,可作為判定假陽性的一個(gè)依據(jù)。以及上述所提及的質(zhì)粒的酶切,都是最常用的方法。

保存條件

置于–20°C保存,完全解凍并搖勻,置于冰上備用,使用過程中避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品應(yīng)用

快速克隆
高通量克隆無縫克隆

DNA定點(diǎn)突變

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