百邁客合作單位中山大學在化學期刊Angew. Chem. Int. Ed上發(fā)表關于偶聯臨床鐵螯合劑的線粒體靶向錸(I)配合物，以期達到同時破壞線粒體代謝和細胞內鐵穩(wěn)態(tài)的目的，并從表觀組學揭示其抗腫瘤效果，該研究提供了一種通過干預線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)來調節(jié)癌癥表觀基因組的抗癌新策略。其中RNA-seq數據差異及功能富集分析等由百邁客完成，此外百邁客業(yè)務還包括單細胞轉錄組、空間轉錄組、單細胞ATAC&GEX、單細胞免疫組庫等，有興趣的老師可以聯系當地銷售。

英文題目：Recoding Cancer Epigenome by Intervening Metabolism and Iron Homeostasis with Mitochondria-Targeted Re(I) Complexes

中文題目：通過線粒體靶向Re(I)復合物干預代謝和鐵穩(wěn)態(tài)來記錄癌癥表觀基因組

期刊雜志：Angew. Chem. Int. Ed

影響因子：15.336

合作單位：中山大學

原文鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32634290

導讀

表觀遺傳修飾主要包括翻譯后組蛋白修飾、DNA甲基化修飾和RNA修飾，這些修飾通過調節(jié)轉錄和染色質結構影響基因表達。表觀遺傳修飾機制包括修飾轉移酶、修飾識別蛋白和去修飾轉移酶，分別用于添加、識別和去除這些修飾位點。其中組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)和DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)抑制劑已被證實可用于臨床。組蛋白和RNA去甲基化酶也成為有前景的抗癌靶點。有趣的是，DNMTs和HDACs的抑制劑表現出協同抗癌作用，和組蛋白甲基化引導m6A修飾共轉錄，表明這些表觀遺傳修飾密切相關。三陰性乳腺癌(TNBC)以雌激素、孕激素和HER-2基因缺失為特征，因其死亡率高、預后差，是乳腺癌死亡的主要原因。最近的研究表明，表觀遺傳修飾在TNBC（三陰乳腺癌）的進展和治療中發(fā)揮重要作用。

研究表明組蛋白和RNA去甲基酶有希望成為有效的抗腫瘤靶標。表觀遺傳調節(jié)涉及到多種組蛋白、DNA和RNA修飾相關蛋白的協同作用，同時調控這些修飾有可能發(fā)揮協同抗癌作用。然而，許多表觀遺傳調節(jié)蛋白尚無有效的抑制劑/激活劑，因此，發(fā)揮這些修飾的協同作用面臨巨大挑戰(zhàn)。最近研究發(fā)現，干擾線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)是非常有前景的抗癌策略。線粒體代謝中的中間產物是組蛋白/DNA/RNA去甲基化酶的輔因子或天然的抑制劑；而鐵則是這些生物大分子Fe(II)/2-氧代戊二酸依賴性去甲基酶的活性中心。
本文設計了偶聯臨床鐵螯合劑的線粒體靶向錸(I)配合物，以期達到同時破壞線粒體代謝和細胞內鐵穩(wěn)態(tài)的目的。其中，DFX-Re3可以將細胞中的鐵重新定位到線粒體，并干擾線粒體代謝，包括與表觀遺傳修飾密切相關的關鍵代謝物，并對三陰性乳腺癌表現出高選擇性殺傷效果。此外，鐵的重新定位導致Fe(II)/2-氧代戊二酸依賴性去甲基酶的下調。結果顯示，DFX-Re3可以同時提高DNA、RNA和組蛋白的甲基化水平，最終改變RNA聚合酶II的活性以及基因表達圖譜（RNA測序）。機制研究表明DFX-Re3可以誘導細胞免疫原性凋亡，并在體內表現出顯著的抗腫瘤活性。該研究提供了一種通過干預線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)來調節(jié)癌癥表觀基因組的抗癌新策略。

研究方法與材料

研究方法：

（1）線粒體靶向錸(I)配合物合成與表征，主要加入臨床鐵螯合劑脫鐵石(DFX)；

（2）DFX-Re3在 MDA-MB-231 cells中定位實驗；

（3）ICP-MS測定MDA-MB-231細胞內鐵的分布；

（4）WB檢測DFX-Re3對甲基化組蛋白H3表達影響；

（5）通過RNA-seq檢測FX-Re3對MDA-MB-231 cells轉錄組表達譜的改變；

研究材料:

MDA-MB-231 cells（三陰乳腺癌）、MCF-7 cells(乳腺癌) 、MCF-10A cells(正常乳腺上皮細胞)

研究結果

1、線粒體靶向錸(I)配合物DFX-Re3合成與表征

文章設計了三個線粒體靶向錸(I)配合物，其中加入了一種臨床鐵螯合劑脫鐵石(DFX)，以同時干擾線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)。其中，DFX-Re3可以將細胞鐵遷移到線粒體，干擾線粒體代謝，包括與表觀遺傳修飾相關的關鍵代謝物。

圖1.線粒體靶向靶向錸(I)配合物干擾線粒體和鐵穩(wěn)態(tài)調控表觀修飾

在三陰乳腺癌細胞、乳腺癌細胞、正常乳腺上皮細胞毒性實中進一步表明DFX-Re3對TNBC細胞具有選擇性細胞毒性。

表1. DFX-Re3對細胞毒性實驗

2. DFX-Re3影響線粒體代謝和關鍵表觀遺傳代謝物

基于以上研究，以活性最強的化合物DFX-Re3為模型化合物，研究其抗癌機制。共聚焦顯微鏡顯示，DFX-Re3能有效穿透MDA-MB-231細胞。DFX-Re3和MitoTracker Deep Red具有較高共定位系數（94%） 。電感耦合等離子體質譜實驗顯示DFX-Re3在線粒體中逐漸富集，并且DFX-Re3影響表觀關鍵代謝物在線粒體中富集。DFX-Re3處理影響多種代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、嘧啶代謝、嘌呤代謝和戊糖磷酸代謝。

DNA/RNA去甲基化酶和大部分組蛋白去甲基化反應以α- kG為輔助因子，琥珀酸(SU)和富馬酸(FU)為抑制因子。SAM是組蛋白/DNA/RNA甲基轉移酶的甲基供體，SAH是反應產物，是組蛋白/DNA/RNA甲基轉移酶的競爭性抑制劑。在DFX-Re3處理的細胞中，α-kG(約1.36倍)和SAH(約21.2倍)下調，而SU(約1.57倍)和FU(約4.3倍)上調。超高效液相色譜-質譜(UHPLC-MS)顯示，DFX-Re3處理組細胞α-KG水平較對照組降低0.87倍。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)顯示，DFX-Re3處理的細胞中SAM/SAH的比例增加了25.7倍(5 M, 6 h）。有趣的是,這些代謝物的變化都有利于甲基化水平的提高，DFX-Re3對糖酵解能力和糖酵解儲備具有明顯的劑量依賴性抑制作用。DFX-Re3不僅影響線粒體代謝平衡，還使得細胞內整體甲基化修飾水平上調，那DFX-Re3如何影響線粒體調控表觀修飾呢？這背后的機理如何呢？繼續(xù)看下文解讀

圖2. DFX-Re3影響線粒體代謝和關鍵表觀遺傳代謝物

3. DFX-Re3調控機制

（1）ICP-MS實驗：DFX-Re3將細胞中鐵轉移到線粒體

用DFX-Re3孵育細胞后，ICP-MS顯示線粒體中鐵含量增加，而細胞質中鐵含量減少。全細胞和細胞核中鐵含量均無明顯變化。未加DFX的Re3對鐵的亞細胞分布無明顯影響。并且，正如預期的那樣，DFX-Re3在線粒體中積累Fe產生大量ROS，導致細胞生存力下降。

圖3. DFX-Re3調控鐵穩(wěn)態(tài)平衡

（2）質譜實驗：DFX-Re3使甲基化水平上升

由于DFX-Re3可以影響鐵和關鍵表觀遺傳代謝物的細胞分布，而這些代謝產物與Fe(II)/2-氧戊二酸依賴性去甲基化酶的活性密切相關，進一步探索DFX-Re3對甲基化水平的影響。DFX-Re3處理后，H3在5個最常見位點的甲基化水平均升高。DFX-Re3處理導致5mC增加。發(fā)現TNBC全基因組低甲基化，但DNA甲基化狀態(tài)改變在TNBC發(fā)生中的作用尚需進一步研究。在DFX-Re3的作用下，[34]5hmC(5-羥甲基胞嘧啶)明顯降低，這與文獻報道TET的抑制會阻止5hmC的形成相一致。在DFX-Re3處理的細胞中檢測到m6A(m6a, mRNA上最普遍的甲基化形式)的增加，這可能歸因于FTO活性的降低。

圖4. DFX-Re3調控甲基化水平

（3）WB實驗：DFX-Re3改變鐵穩(wěn)態(tài)影響修飾酶的活性

通過免疫印跡實驗發(fā)現DFX-Re3處理后抑制甲基化組蛋白H3、JMJD2A、TET2、FTO等甲基化修飾酶的表達。細胞質中鐵含量的降低，同時這些結果表明，鐵在細胞內轉移到線粒體可以增加DNA、RNA和組蛋白甲基化水平。

圖5. DFX-Re3改變鐵穩(wěn)態(tài)影響修飾酶的活性

4. RNA-seq: DFX-Re3改變細胞的轉錄組表達譜

組蛋白/DNA/ RNA甲基化可以影響染色質狀態(tài)和基因轉錄，作者使用RNA-seq研究DFX-Re3對轉錄組的影響。實驗結果表明754個基因表達水平發(fā)生顯著變化，其中上調基因470個，下調基因284個。功能富集分析（GO、KEGG）顯示，DFX-Re3主要影響與線粒體[37]和表觀遺傳調控[38]密切相關的信號通路，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、forkhead box O, FoxO、細胞凋亡、p53、PIK3/Akt和MAPK信號通路。
基因本體分析顯示，在DFX-Re3處理后，RNA聚合酶II啟動子、染色質、生長因子活性、細胞內受體信號通路等均發(fā)生了顯著變化。

圖6. DFX-Re3改變細胞的轉錄組表達譜

5. DFX-Re3體內體外功能驗證實驗：抗癌活性

在體內和體外評估了DFX-Re3的抗癌機制。透射電鏡觀察顯示，DFX-Re3 (2 M, 24 h)處理后線粒體明顯膨脹，提示MMP缺失。濃度較高時，細胞核邊緣和中心出現染色質凝聚，細胞核碎裂，提示晚期凋亡。Annexin V/碘化丙啶(PI)雙染色顯示，在DFX-Re3處理的樣品中，凋亡早期和晚期細胞比例呈劑量依賴性增加(圖S36)。DFX-Re3激活caspase 3/7, Z-VAD-FMK(泛caspase抑制劑)預處理可抑制細胞死亡率。與之前的RNA-seq結果一致，DFX-Re3可以誘導多種免疫相關基因的表達改變，DFX-Re3誘導免疫相關基因表達改變。誘導鈣網蛋白調控，這是免疫原性死亡的重要分子標記。這些結果表明，DFX- Re3可誘導caspase依賴的免疫原性凋亡。體內抗腫瘤實驗中，DFX-Re3未見小鼠死亡或體重明顯減輕，治療結束時，DFX-Re3未見臟器明顯病理改變。這些數據表明，DFX-Re3在體內具有高的抗癌作用和低的全身毒性。

圖7. DFX-Re3體內體外抗癌活性驗證

研究結論

該作用機制研究發(fā)現，本設計具有以下幾個顯著優(yōu)勢：(1) DFX-Re3影響線粒體代謝中與表觀遺傳修飾相關的代謝物；(2) DFX-Re3將細胞鐵富集于線粒體并誘導線粒體產生大量活性氧；(3) DFX-Re3同時提高組蛋白、DNA和RNA的甲基化水平；(4) DFX-Re3改變轉錄組，尤其是RNA聚合酶II的活性；(5) DFX-Re3誘導細胞免疫原性凋亡并在體內表現出很高的抗癌活性和低的全身毒性。

本研究提出了一種新的策略來編碼癌癥表觀基因組，并開發(fā)對傳統(tǒng)化療耐藥的腫瘤治療。
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