近期百邁客微生物合作文章頻出，成都中醫(yī)藥大學(xué)2021年8月11日在Frontiers in Pharmacology 雜志上發(fā)表了題為“Phillygenin Attenuates Carbon Tetrachloride-Induced Liver Fibrosis via Modulating Inflammation and Gut Microbiota”文章，腸道微生物作為人類的第二基因組，越來越多的研究表明腸道微生物與疾病的發(fā)病及治療密切相關(guān)。三代微生物多樣性以其注釋更準(zhǔn)確、注釋種水平等優(yōu)勢更有利于微生物的研究，據(jù)不完全統(tǒng)計，百邁客累計發(fā)表SCI論文500余篇，累計影響因子1900+，促進(jìn)了微生物研究領(lǐng)域的發(fā)展。
英文題目：Phillygenin Attenuates Carbon Tetrachloride-Induced Liver Fibrosis via Modulating Inflammation and Gut Microbiota
中文題目：PHI通過調(diào)節(jié)炎癥和腸道菌群來減輕CCl4誘導(dǎo)肝纖維化
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.81
合作單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)
文獻(xiàn)鏈接：https://doi.org/10.3389/fphar.2021.756924
研究背景
肝纖維化是多種病原體引起的慢性肝損傷過程中肝內(nèi)結(jié)締組織發(fā)生發(fā)育不良的動態(tài)病理生理過程。常見的致病因素包括病毒性肝炎、化學(xué)藥物或毒物、自身免疫性疾病、遺傳和代謝性疾病。近年來，大量文獻(xiàn)表明腸道菌群紊亂在抗肝纖維化藥物的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)可以緩解肝纖維化的進(jìn)展。
連翹素（PHI）具有良好的保肝作用，通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)和LX2細(xì)胞的激活，從而緩解肝纖維化。此外，鑒于腸道菌群在肝纖維化發(fā)展過程中的重要作用，PHI的抗纖維化作用是否部分依賴于腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)尚不清楚。
材料方法
試驗材料：36只8周齡雄性C57BL/6J小鼠，每組6只
試驗方法：HE染色、血清生化指標(biāo)檢測、免疫組化、16S rRNA測序、q-PCR等
圖1試驗大綱：PHI化學(xué)結(jié)構(gòu)、各組小鼠治療流程圖和試驗設(shè)計說明
研究結(jié)果
1、HE染色及血清生化指標(biāo)結(jié)果
如圖2A所示，HE染色顯示正常對照組和溶劑對照組肝細(xì)胞排列緊密，未見明顯肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞病變和炎癥細(xì)胞浸潤。在CCl4處理的小鼠中，觀察到顯著的肝細(xì)胞脂肪變性、嗜酸性胞漿增強(qiáng)和膠原纖維增殖。
血清生化指標(biāo)結(jié)果見圖2B所示，正常對照組與溶劑對照組無顯著差異。與溶劑對照組相比，CCl4組ALT、AST、ALP和γ-GT水平顯著升高。與CCl4組相比，PHI組顯著降低了ALT、AST、ALP和γ-GT水平。
圖2 PHI對小鼠肝纖維化病理及血清生化指標(biāo)的影響
2、膠原沉積及肝臟生化指標(biāo)結(jié)果
觀察纖維組織分布、Masson染色及Sirius red染色。如圖3A和B所示，Masson染色時膠原纖維呈藍(lán)色，Sirius red染色時呈紅色。結(jié)果表明，正常對照組和溶劑對照組幾乎不產(chǎn)生膠原纖維，而CCl4可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的膠原纖維。有趣的是，PHI處理顯著減少了肝臟中膠原的積累。
肝臟生化指標(biāo)結(jié)果如圖3C-G所示，正常對照組與溶劑對照組無明顯差異。與溶劑對照組相比，CCl4組的HYP、HAase、LN、IV-C和PC III水平更高。與CCl4組相比，PHI組HYP、HAase、LN、IV-C和PC III水平顯著降低。
圖3 PHI對小鼠肝纖維化膠原沉積及肝臟生化指標(biāo)的影響
3、PHI能抑制肝星狀細(xì)胞的活化
肝纖維化通常伴有造血干細(xì)胞活化，而α-SMA是造血干細(xì)胞活化的標(biāo)志，而I型膠原是ECM的主要成分之一。為了研究PHI對肝纖維化造血干細(xì)胞激活的影響，作者通過檢測α-SMA和I型膠原的表達(dá)水平來確定PHI是否能抑制肝纖維化造血干細(xì)胞的激活。如圖4所示，α-SMA和I型膠原蛋白被染成黃色。結(jié)果表明，正常對照組和溶劑對照組很少觀察到α-SMA和I型膠原，而CCl4處理顯著增加了肝臟α-SMA和I型膠原陽性細(xì)胞。而PHI處理后α-SMA和I型膠原免疫反應(yīng)細(xì)胞明顯減少。
圖4 PHI對α-SMA及膠原蛋白I表達(dá)的影響
4、PHI可以抑制炎癥
為了評價PHI的抗炎作用，作者檢測了血清中LPS、MIP-1和TNF-α的水平。如圖5所示，正常對照組與溶劑對照組LPS、MIP-1和TNF-α水平差異不顯著。與溶劑對照組相比，CCl4組LPS、MIP-1和TNF-α水平顯著升高。20和40mg/kg PHI可顯著降低LPS、MIP-1和TNF-α水平。
圖5 PHI可以抑制炎癥
5、PHI對CCl4誘導(dǎo)的腸上皮屏障破壞具有保護(hù)作用
如圖6A所示，HE染色顯示正常對照組和溶劑對照組回腸內(nèi)絨毛和腸腺排列整齊，分布均勻。CCl4處理組回腸出現(xiàn)大量的腸腺上皮細(xì)胞變性、細(xì)胞腫脹、絨毛紊亂和破裂。相比CCl4組，PHI處理組小鼠腸腺上皮細(xì)胞變性、腫脹及回腸炎癥細(xì)胞浸潤均不同程度緩解，腸絨毛更加有序、規(guī)則。
此外，作者測量了各組小鼠回腸絨毛高度、寬度和隱窩深度，結(jié)果如圖6B-D所示。正常對照組與溶劑對照組無明顯差異。與溶劑對照組相比，CCl4組回腸絨毛高度、寬度和隱窩深度顯著減少。PHI（20和40mg/kg）處理后上述指標(biāo)減少均可逆轉(zhuǎn)。綜上所述PHI可以顯著改善腸道損傷。
圖6 PHI對CCl4誘導(dǎo)的腸上皮屏障破壞具有保護(hù)作用
6、PHI改變腸道菌群結(jié)構(gòu)
對36個樣品進(jìn)行測序，每個樣品平均產(chǎn)生7507條CCS。97%相似性聚類得到982個OTUs。使用Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評估腸道菌群的豐富度、多樣性和均勻度（圖7A）。CCl4組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著高于溶劑對照組。PHI（20和40 mg/kg）處理組顯著回復(fù)上述指標(biāo)。PCoA圖顯示溶劑對照組、CCl4組和不同濃度PHI組之間腸道菌群發(fā)生變化（圖7B）。這些結(jié)果證實(shí)了在肝纖維化的過程中微生物菌群發(fā)生明顯變化，PHI起到糾正的作用。
門水平，CCl4組厚壁菌門（Firmicutes）顯著減少，變形菌門（Proteobacteria）顯著增加（圖7C）。PHI處理組顯著逆轉(zhuǎn)了上述菌門的相對豐度（圖7D）。擬桿菌門/厚壁菌門在CCl4組顯著增加，而PHI（20和40mg/kg）組顯著降低（圖7E）。
圖7 PHI調(diào)節(jié)腸道菌群組成
7、PHI在屬和種水平上改善CCl4誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂
作者研究了CCl4和PHI處理后腸道菌群在屬水平的具體變化（圖8A）。屬水平CCl4組(Eubacterium)_coprostanoligenes_group相對豐度增加（圖8B）。PHI逆轉(zhuǎn)了這種菌的豐度。PHI組Ruminococcaceae_UCG-014 and Lactobacillus相對豐度增加（圖8B）。種水平CCl4和PHI組一些細(xì)菌豐度發(fā)生變化（圖8C）。CCl4增加了uncultured_bacterium_g_(Eubacterium)_coprostanoligenes_group相對豐度（圖8D）。PHI逆轉(zhuǎn)了該菌的豐度。PHI處理增加了uncultured_bacterium_g_Ruminococcaceae_UCG-014相對豐度（圖8D）。
LEfSe分析與上述結(jié)果相似（圖8E）。結(jié)果表明正常對照、溶劑對照組、CCl4、CCl4+10mg/kg PHI、CCl4+20mg/kg PHI和CCl4+40mg/kg PHI組富集的差異菌為12、3、3、9、2和12個（圖8F）。
綜上所述，這些結(jié)果進(jìn)一步說明PHI通過腸道菌群來減弱CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。
圖8 PHI調(diào)節(jié)腸道菌群組成
8、功能預(yù)測和相關(guān)性分析
作者通過KEGG和COG數(shù)據(jù)庫預(yù)測了微生物的功能（圖9A和B）。CCl4處理組富集的通路為energy production and conversion、membrane transport和signal transduction mechanisms。肝纖維化小鼠PHI處理后，微生物富集的通路為carbohydrate transport and metabolism、lipid transport and
metabolism、metabolism of cofactors and vitamins、defense mechanisms、transcription和coenzyme transport and metabolism。
隨后分析血清生化指標(biāo)與腸道菌群相關(guān)性。如圖9C所示，Phascolarctobacterium與ALP、ALT、MIP-1、LPS、AST、TNF-α顯著負(fù)相關(guān)。Roseburia與ALT顯著負(fù)相關(guān)。Rodentibacter與ALP、AST和TNF-α顯著正相關(guān)。此外還分析了肝臟生化指標(biāo)與腸道菌群相關(guān)性。如圖9D所示，Phascolarctobacterium與HYP、α-SMA、Collagen Ⅰ、HAase、LN 和IV-C顯著負(fù)相關(guān)。Roseburia與HYP、HAase和LN顯著負(fù)相關(guān)。Escherichia與HYP、α-SMA、Collagen Ⅰ和HAase顯著正相關(guān)。Rodentibacter與HYP、α-SMA、Collagen Ⅰ、LN 和IV-C顯著正相關(guān)。
圖9 腸道菌群功能預(yù)測及相關(guān)性分析
9、RT-qPCR
首先，作者分析了α-SMA和Collagen I的mRNA表達(dá)情況。如圖10A所示，與溶劑對照組相比CCl4組α-SMA和Collagen I表達(dá)顯著升高。隨后研究了IL-1β、IL-6和TNF-α 三種炎癥因子mRNA表達(dá)情況。如圖10B所示，與溶劑對照組相比CCl4組肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平升高。
腸道屏障的破壞是肝纖維化的一種重要的腸道改變。因此采用RT-qPCR檢測和量化腸道屏障重要的標(biāo)志物ZO-1、 Occludin和Claudin-1。如圖10C所示，相比于溶劑對照組，CCl4組ZO-1、 Occludin和Claudin-1基因表達(dá)顯著降低。
圖10 溶劑對照組、CCl4、CCl4、CCl4+10mg/kg PHI、CCl4+20mg/kg PHI和CCl4+40mg/kg PHI組mRNA相對表達(dá)量
總結(jié)
給藥PHI可通過調(diào)節(jié)炎癥和腸道微生物減少CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。綜上所述，作者研究清楚并證明了PHI可以改善CCl4引起的肝臟組織病理損傷、肝功能異常、膠原沉積、內(nèi)毒素血癥和纖維化。通過16S rRNA測序和分子生物學(xué)分析探討了分子機(jī)制，PHI的肝臟保護(hù)作用涉及調(diào)節(jié)炎癥和腸道菌群。本研究可能為PHI在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化中的治療策略提供一種潛在的新思路。
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