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英文題目：Comprehensive diagnostics of acute myeloid leukemia by whole transcriptome RNA sequencing

中文題目：全轉(zhuǎn)錄組RNA測序?qū)毙运柘蛋籽〉木C合診斷

期刊：Leukemia

影響因子：11.528

發(fā)表日期：2020.3.3

摘要

急性髓細胞白血病(AML)是由基因變異引起的，基因變異也控制著患者的預后，并指導風險適應和靶向治療。急性髓系白血病的遺傳變異在結構上是多樣的，目前通過不同的診斷分析來檢測。本研究旨在建立全轉(zhuǎn)錄組核糖核酸測序作為AML診斷的單一、全面和靈活的平臺。我們開發(fā)了HAMLET(人類急性髓細胞白血病快速轉(zhuǎn)錄組學)作為生物信息學管道，用于同時檢測fusion genes、small variants、tandem duplications和gene expression，所有信息都集中在一個被注釋的、簡易的輸出文件中。對100例急性髓系白血病患者進行了全轉(zhuǎn)錄組RNA測序，并通過reference assays和targeted resequencing驗證了HAMLET結果。數(shù)據(jù)顯示，HAMLET z確地檢測到所有融合基因和過表達EVI1與3q26突變無關。此外，AML中經(jīng)常突變的13個基因的small variants有99.2%的敏感性和100%的特異性，以及FLT3和KMT2A的tandem duplications以100%的靈敏度和97.1%的特異性通過了新算法檢測。總之，HAMLET有潛力成為在單一技術平臺上提供與AML分類、風險評估和靶向治療相關的z確全面的診斷信息的平臺。

背景介紹

急性髓系白血病(AML)是由功能互補的基因突變引起的，這些突變導致髓系前體細胞不斷增殖和成熟被抑制。顯性 AML 平均攜帶13個非同義突變。造血干細胞中AML起始突變的獲得可能比AML診斷早幾十年。2016版的WHO classification of hematologic malignancies區(qū)分臨床和預后重要性的九種AML亞型。在50-55%的AML病例中進行對遺傳變異的風險評估的z確分類，并可能指導靶向治療。在80-85%的AML病例對重復突變基因的擴展組的基因組進行分類。

然而，急性髓細胞白血病的z確分類需要不同的技術來捕獲結構多樣的基因突變，如較大的插入和缺失(indels)、融合基因和除小變異外的結構性染色體變異。此外，結構正常基因的表達水平可對預后產(chǎn)生決定性影響。因此，在當前的技術平臺下，急性髓細胞白血病診斷及風險評估仍然繁瑣、貴，且不完整。為了解決這一需求，我們實施了全轉(zhuǎn)錄組RNA測序(mRNAseq)，作為獲取與當前和未來分類和風險分類相關的所有遺傳信息的單一平臺。在這種診斷范式中，一個經(jīng)認可的mRNAseq協(xié)議獲取診斷樣本的全面數(shù)據(jù)。對于單次運行數(shù)據(jù)分析，我們開發(fā)了一個指定的集成生物信息管道(人類急性髓細胞白血病快速轉(zhuǎn)錄組學(HALLET)；Fig. 1)。HAMLET具有靈活的適應性和個性化，可以查詢一組選定基因的序列變異和表達水平，以及易位情況。

實驗材料

從萊頓大學醫(yī)學中心(LUMC)的血液學生物庫中選擇了100份經(jīng)機構審查委員會批準獲得的冷凍保存的急性髓系白血病樣本。所有樣本都進行了基因分型NPM1突變和FLT3內(nèi)部串聯(lián)復制(FLT3-ITD)由LUMC分子診斷實驗室認證。

實驗方法

全轉(zhuǎn)錄組測序，HAMLET輸出的驗證

結果

經(jīng)認證的mRNAseq在100個AML樣本上產(chǎn)生了4885萬個reads(9700-17000萬個reads)，平均插入大小為149-177個堿基。質(zhì)量控制后的平均閱讀長度為123–124個堿基。
融合基因檢測

HAMLET在24例病例中z確檢測到中期細胞遺傳學預測的所有復發(fā)融合基因(Fig. 2a)。另外3例除t(9;11)(p21;q23)外的11q23易位病例，HAMLET正確識別了KMT2A融合相關基因MLLT1,MLLT4，和MLLT6(圖1，2)。此外，HAMLET在8例病例中正確識別了融合轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本不能通過中期核型分析預測，但與急性髓系白血病的預后相關(圖2b)。FUS-ERG 檢測到融合基因，其對應的t(16；21)(p11；q22)僅在其復雜核型中被鑒定。攜帶ETV6-LYN融合基因的AML(2-020)的核型為add(8)(q24)和del(12)(p13)，但缺乏特征ins(12;8)(p13;q11q21)。三個AML (2-003，2-031，2-032)發(fā)現(xiàn)NUP98-NSD1融合轉(zhuǎn)錄本。由于兩個參與基因的端粒位置NUP98-NSD1源于t(5；11)(q35；p15.5)，因此目前未被AML分類，盡管其與不良預后相關。在三個病例(2-053、3-021、3-024)中發(fā)現(xiàn)PIM3-SCO2發(fā)生了基因融合。此前已在兒童急性髓系白血病中發(fā)現(xiàn)，可起源于慢性中性粒細胞白血病的0.6 Mb號染色體倒位。

HAMLET提供了融合轉(zhuǎn)錄物的詳細信息，包括差異剪接(KMT2A-MLLT3、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARA、CBFB-MYH11和NUP98-NSD1)和來自平衡易位的相互轉(zhuǎn)錄物，例如，RARA-PML, ERG-FUS, NUP214-DEK, 和 NSD1-NUP98。總之，HAMLET檢測到54種不同的融合轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄物不能通過中期核型分析預測。總的來說，28例急性髓系白血病攜帶兩個或多個融合，在一個復雜的AML中*多有9個不同的融合基因。

small variants檢測

HAMLET的VARSCAN組件在13個AML基因中鑒定出246個小變異體。HAMLET對NPM1和DNMT3A的FLT3-ITD和熱點區(qū)域進行了敏感性評估，對其余的418個被HAMLET稱為野生型的樣本進行了靶向重測序反應。VARSCAN只識別了七個相當短的FLT3-34人中的ITDFLT3-ITD攜帶AML。在這種情況下，HAMLET都正確地識別了一個ASXL1(3-030)的30bp C末端插入和CEBPA (3-003)中一個N端易位。HAMLET檢測到的小變異體的總體類型和分布與在COSMIC中報告的分布非常一致。

HAMLET檢測的變異在COSMIC中列出并位于定義的遺傳熱點內(nèi)，很容易被解釋為A類變異(n = 114;46.3%)。COSMIC中報告了60種變異(24.4%)，但沒有位于熱點。這些B類變異大部分在已知突變發(fā)生在整個編碼序列中的基因中被檢測到(CEBPA,TET2，RUNX1,WT1和TP53).其余變異并未報告(C類變異體:n= 52;21.1%)或未在COSMIC中列出但被描述為SNP(D類變異體，n= 20;8.1%).D類變異可能代表真正的低等位基因頻率的遺傳多態(tài)性。C類變異體可以根據(jù)其預測的致病作用來解釋。按這種規(guī)定進行解釋，90%以上的A類變異，50%的B類和C類變異體和小于1%的D類變異體是髓系惡性腫瘤的復發(fā)突變。

在TCGA AML隊列中，基因組DNA中存在的小變體已被證明在相應的RNA序列分析中是不存在的。因此，我們驗證了小變異的HAMLET結果RUNX1,TET2,TP53,DNMT3A,KIT1，和IDH1通過靶向NGS對從56例急性髓系白血病分離的基因組DNA。選擇這些病例是因為TP53，RUNX1和TET2的遺傳特征與基因突變增加的可能性有關，在這56例AML病例中，HAMLET檢測到67個變異，包括18個易位，它們是無義介導的RNA衰變的潛在靶點。在這67個變體中，有一個TET2三例急性髓系白血病病例中的變異體(c.4317dup)被目標NGS遺漏。這個A插入發(fā)生在6個其他A核苷酸的延伸中，顯然很難在Ion GeneStudio S5系統(tǒng)上進行排序。原始數(shù)據(jù)中存在這種變異的Reads，等位基因頻率為2-3%。還有兩個變異被目標NGS發(fā)現(xiàn)，但被HAMLET錯過了。這些變異包括RUNX1是已被靶向NGS檢測到的錯義變異體，具有10%的低等位基因頻率和IDH1。總之，我們的數(shù)據(jù)顯示，HAMLETz確地調(diào)用了TET2,TP53,RUNX1,KIT,IDH1和DNMT3A包括由轉(zhuǎn)錄物編碼的所有變異，這些轉(zhuǎn)錄物是無義介導的衰變的潛在目標。我們還確定了HAMLET-RNAseq檢測所需的測序深度，并對100個急性髓系白血病進行了20萬、30萬、40萬和4750萬個讀對的流水線操作。在HAMLET所稱的246個變異中，有53個變異是無義突變或移碼突變。HAMLET檢測這些變異的z確度從100%、96%、85%下降到70%，而其余變異體的z確度從100%、98%、96%下降到81%。這些數(shù)據(jù)表明，約測5000萬個reads的高測序深度對于確保檢測所有變異類型是必不可少的。

等位基因的CEBPA突變?yōu)楹诵驼５腁ML帶來了良好的預后并且將一個等位基因上編碼序列的第一個357 bp內(nèi)的N-末端移碼突變與c.834-1074之間的C-末端框內(nèi)插入或缺失相結合，從而破壞另一個等位基因上的DNA結合。通過Illumina平臺上通?？色@得的reads長度來證明它們在相反染色體上的位置。然而，雙等位基因CEBPA突變與特定的基因表達譜有關?；趍RNAseq的基因表達譜顯示了特征性的雙等位基因CEBPA攜帶兩個樣本的所有四個急性髓系白血病樣本的突變相關特征CEBPA突變(2-009、2-039、2-045和3-003)，包括其C端突變被HAMLET遺漏的病例3-003(圖3)。11例急性髓系白血病中，有一例CEBPA變異，一個病例(2-025)的特征性N-末端移碼突變與雙聚在一起CEBPA變異。因此，將變異檢測與基因表達譜結合分析，可以單獨解決變異檢測的不確定性。由于CEBPA 雙突變體的基因標記不是定量的，所以尚未在HAMLET中實施臨床應用。

檢測中的串聯(lián)重復FLT3和KMT2A

外顯子中常見串聯(lián)重復的可靠檢測FLT3在急性髓系白血病診斷中尤為重要，因為FLT3-ITD是酪氨酸激酶抑制劑治療的適應癥。除了對FLT3-ITD，其位置、大小和突變與等位基因比率對急性髓系白血病的預后有重要影響。為了改善對不充分的檢測FLT3-ITD通過VARSCAN，我們開發(fā)了ReSCU作為一種新的算法，該算法基于在相互基因位置發(fā)生的部分對齊、SC reads的調(diào)用。

ReSCU確定了36例有FLT3-ITD，包括由VARSCAN檢測到的所有7例small ITD病例和經(jīng)認證診斷確定的所有34例病例(圖4a)。NGS的有針對性的重新排序進一步證實了FLT3-除了兩種情況之外，所有情況下，ITD都處于軟限幅方法確定的位置(表SXIV).在兩個由ReSCU調(diào)用但不是由標準診斷調(diào)用的不一致案例中，SC reads占其各自位置總覆蓋率的小于1%。仔細審查原始數(shù)據(jù)顯示FLT3-在這兩種情況下，ITD信號都低于檢測閾值，表明HAMLET的靈敏度更高(圖S6).突變型與正常型的等位基因比FLT3片段與ReSCU調(diào)用的SC reads百分比有很好的相關性(圖4b).

KMT2A-PTD外顯子2–13，這對于將AML 分類到染色質(zhì)剪接組，導致蛋白質(zhì)延長，對AML的臨床結果產(chǎn)生不利影響。ReSCU識別的KMT2A-PTD外顯子2-8和2-10分別出現(xiàn)在4和2病例中，外顯子2、2-3和3-6的重復出現(xiàn)在單個病例中(圖4c)。全部九個KMT2A-PTD通過 RT-PCR和測序進行驗證。

基因過表達的檢測

結構正?；虻倪^度表達會影響急性髓系白血病患者的預后BAALC, ERG, MN1, DNMT3B, SPARC, and EVI1。mRNAseq測量過表達的可靠性被評估為預示AML預后非常差的EVI1轉(zhuǎn)錄本(圖5a)。過表達EVI1可由inv(3)(q21q26)或t(3;3)(q21;q26)，但是存在替代的分子機制。mRNAseq檢測到的EVIl外顯子1的表達與定量RT-PCR檢測結果有很好的相關性(圖5b).兩例(1- 005,3 -029)攜帶inv(3)(q21q26)和1例(1-008)攜帶t(3;8)(q26;q24)均可見高EVI1表達。在另外4例EVI1高表達的病例中，1例有der(3)t(1;3)(q3?1;q2?5)，沒有可識別的MECOM1位點參與(病例3-022)。這3例EVIl過表達而無3q26異常的病例均攜帶KMT2A融合轉(zhuǎn)錄本(case 1-001和3-008:KMT2A-MLLT3；case2-047:KMT2A-MLLT4)。這種遺傳變異的組合表明AML的預后極差。

Fig. 5 Detection of EVI1 overexpression. a Schematic representation of two mRNA transcripts from the MECOM locus on chromosome 3. One transcript contains exon 1–2 of MDS1 fused to exon 2–15 of EVI1 (MDS1-EVI1 transcript), whereas the other transcript contains exon 1–15 of EVI1 (EVI1 transcript). b Comparison of EVI1 expression by RNAseq and quantitative RT-PCR. Xaxis: Expression of the first exon of EVI1 normalized for expression of the PBGD housekeeping gene by quantitative RT-PCR (log2 EVI1/PBGD). Y-axis: Sum of base coverage of the first exon of EVI1 per kb transcript and one million mapped reads (log2 BPKM) by RNAseq

克隆進化

HAMLET揭示了克隆進化，在診斷和復發(fā)時采集的所有四對樣本中獲得和丟失了遺傳變異。盡管基因型明顯不同，但IDH2突變作為起始事件的持續(xù)存在確立了新生AML和后續(xù)治療相關AML的共同起源(case 3-021、3-038)。因此，一個獨立的、與治療相關的AML的診斷被糾正為原始AML的復發(fā)，盡管兩個樣本將被分類為不同的AML亞型。

急性髓系白血病的分類和預測

根據(jù)HAMLET和中期核型分析結果，99例病例可根據(jù)世衛(wèi)組織2016年和基因組分類進行重新分類(圖6)。HAMLET信息促進了6個案例的風險重新評估，值得注意的是通過NUP98-NSD1融合而無分類明確病變的AML，或通過EVIl過表達而無inv(3)(q21q26)來分配風險。

 

原文鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32127641

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