英文題目：Fungal lysozyme leverages the gut microbiota to curb DSS-induced colitis

發(fā)表雜志：Gut Microbes

影響因子：10.302

發(fā)表時(shí)間：2021年10月25日

導(dǎo)讀

結(jié)腸炎的主要癥狀是結(jié)腸炎癥和腸道健康受損，這兩種特征都會(huì)加劇肥胖和胰島素抵抗。宿主防御肽(HDPs)是腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在上述情況下通常會(huì)出現(xiàn)故障。溶菌酶是一種來(lái)自A.alcalophilum特征良好的HDP，本研究的目的在于通過(guò)每日口服溶菌酶來(lái)改善飲食誘導(dǎo)的肥胖和化學(xué)誘導(dǎo)（DSS誘導(dǎo)）的結(jié)腸炎的腸功能。
對(duì)低脂飲食（LFD）和高脂飲食（HFD）的小鼠，每日灌胃溶菌酶12周并設(shè)置對(duì)照組，然后進(jìn)行代謝評(píng)估和結(jié)腸微生物群侵入評(píng)估。為了進(jìn)一步評(píng)估溶菌酶在腸道炎癥的療效，在DSS誘導(dǎo)的常規(guī)小鼠和微生物群缺失小鼠的結(jié)腸炎期間，對(duì)其補(bǔ)充溶菌酶，通過(guò)16S擴(kuò)增子測(cè)序評(píng)估了兩種模型中縱向微生物組的改變。
研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶可劑量依賴性地減輕DSS刺激小鼠的腸道炎癥，可通過(guò)黏液的產(chǎn)生抑制HFD誘導(dǎo)的微生物群侵犯或易位，并可預(yù)防空腹高胰島素血癥。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)溶菌酶保護(hù)腸道健康依賴于一些復(fù)雜的腸道菌群。

在HFD和DSS兩種模型中，Akkermansia muciniphila都與腸道健康受損有關(guān)，而溶菌酶可以緩解這種情況，同時(shí)，PICRUSt2功能預(yù)測(cè)結(jié)果也顯示溶菌酶給藥會(huì)持續(xù)影響一些特定途徑。
總的來(lái)說(shuō)，該研究表明A.alcalophilum來(lái)源的溶菌酶是一個(gè)非常有應(yīng)用前景的促進(jìn)腸道健康的候選物質(zhì)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：

C57BL6/J小鼠適應(yīng)低脂參考飲食（LFD）和高脂參考飲食（HFD）后，每日灌注溶菌酶，之后進(jìn)行代謝評(píng)估和結(jié)腸微生物群侵蝕評(píng)估。

為了進(jìn)一步評(píng)估這種溶菌酶對(duì)腸道炎癥的療效，研究者接下來(lái)對(duì)DSS誘導(dǎo)的常規(guī)小鼠或微生物耗盡的BALB/c小鼠補(bǔ)充溶菌酶。

6周齡的雄性C57BL6/J小鼠或雌性BALB/c小鼠進(jìn)行2周飲食適應(yīng)后：
● C57BL6/J小鼠部分轉(zhuǎn)為高脂飲食（HFD），其余保持低脂飲食（LFD）；口腔灌胃溶菌酶和對(duì)照物，處理至第12周；
分組：HFD+Lyso；HFD+Vehicle；LFD+Lyso；LFD+Vehicle

● BALB/c小鼠：DSS誘導(dǎo)分組：Lyso組，Vehicle組；微生物區(qū)系耗盡小鼠分組：Lyso組，Vehicle組。

主要方法：

生理生化實(shí)驗(yàn)、組織細(xì)胞因子定量、qPCR、FISH、16s rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序、組織病理分析

主要研究結(jié)果

1. 溶菌酶可以緩解飲食誘導(dǎo)的空腹高胰島素血癥，增加黏液的產(chǎn)生，減少其它微生物群的侵蝕

該文章首先研究了溶菌酶對(duì)飲食誘導(dǎo)型肥胖小鼠的潛在影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與喂食LFD的小鼠相比，喂食HFD的小鼠體重增加了更多，每天補(bǔ)充溶菌酶對(duì)身體成分或能量攝入沒(méi)有產(chǎn)生可測(cè)量的影響（圖1a），然而，接受溶菌酶治療的小鼠確實(shí)表現(xiàn)出了更低的空腹胰島素水平（圖1b）。與Vehicle+HFD組相比，溶菌酶更傾向于降低餐后血糖而不是空腹血糖。葡萄糖刺激的胰島素濃度不受溶菌酶補(bǔ)充的影響。與已知可以調(diào)節(jié)腸道滲漏的空腹胰島素減少類似，本文研究者們?cè)谌芫腹辔傅膭?dòng)物中觀察到HFD誘導(dǎo)的腸道通透性出現(xiàn)數(shù)值保護(hù)（圖1e）。這些體內(nèi)跡象表明HFD喂養(yǎng)的小鼠腸道通透性增加，且循環(huán)LPS、腸炎癥以及與結(jié)腸和回腸緊密連接基因的表達(dá)在組間保持相似。盡管如此，溶菌酶還是使HFD誘導(dǎo)的結(jié)腸中Tlr2表達(dá)的減少維持在正常范圍內(nèi)（圖1f）。根據(jù)已有研究顯示，TLR2的激活與結(jié)腸杯狀細(xì)胞的黏液調(diào)節(jié)有關(guān)，因此本文研究者們調(diào)查了黏液的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充溶菌酶可防止HFD誘導(dǎo)的結(jié)腸Muc2下調(diào)（圖1g）。進(jìn)一步的，發(fā)現(xiàn)這種溶菌酶介導(dǎo)的黏液完整性保存，可能是由于腸上皮細(xì)胞到最近細(xì)菌的平均距離增加6倍以上導(dǎo)致，從而說(shuō)明補(bǔ)充溶菌酶足以防止HFD引起的微生物區(qū)系侵蝕（圖1h-i）。

圖1. 溶菌酶降低C57BL6/J小鼠中與Tlr2和Muc2表達(dá)相關(guān)的空腹胰島素水平。

2. 溶菌酶逐步改變腸道微生物群組成及其預(yù)測(cè)功能

由于微生物區(qū)系侵蝕的減少也可能由于溶菌酶具有潛在的殺菌活性，因此本文研究者接下來(lái)評(píng)估了實(shí)驗(yàn)小鼠糞便微生物群的縱向變化。在研究開(kāi)始時(shí)，所有的小鼠都低脂喂養(yǎng)，且微生物組成分析顯示這些小鼠的微生物組成具有相似性。HFD喂養(yǎng)導(dǎo)致了小腸和糞便樣本中的微生物群組成產(chǎn)生了巨大差異（圖2a-d）?？v向抽樣顯示，飲食干預(yù)導(dǎo)致糞便微生物群發(fā)生即時(shí)變化，而溶菌酶給藥的影響逐漸顯現(xiàn)。與其他組相比，每天接受口服溶菌酶的小鼠，其微生物群落在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出獨(dú)特和漸進(jìn)的軌跡（圖2c）。但盡管如此，除在小腸中，一些HFD誘導(dǎo)的糞便微生物變化可以通過(guò)補(bǔ)充溶菌酶來(lái)抵抗（圖2a-f）。微生物群的alpha多樣性不受溶菌酶給藥的影響，說(shuō)明該溶菌酶沒(méi)有相應(yīng)明顯的抗菌作用。與vehicle組小鼠相比，接受溶菌酶的小鼠糞便中大量細(xì)菌ASVs的相對(duì)豐度被修飾了，且受調(diào)控的ASVs大多屬于厚壁菌門(mén)，其中Akkermansia muciniphila和Oscillospira（顫螺菌屬）減少，胃瘤胃球菌屬的一種未分類的胃瘤胃球菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌和異歧桿菌的相對(duì)豐度則增加（圖2e）。此外，由于補(bǔ)充了溶菌酶，4個(gè)細(xì)菌屬顯示在整個(gè)屬水平都發(fā)生了ASVs豐度改變（圖2f），而其它的ASV修飾則呈現(xiàn)出物種依賴性。接下來(lái)，本文研究者們對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示接受溶菌酶的小鼠糞便樣本菌群預(yù)測(cè)功能發(fā)生了顯著變化，而小腸樣本中則沒(méi)有顯著變化（圖2g和圖3f）。

圖2. 溶菌酶影響HFD喂養(yǎng)C57BL6/J小鼠的腸道微生物群組成和預(yù)測(cè)功能

圖3. 劑量依賴性溶菌酶可以防止DSS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠結(jié)腸炎

3. 溶菌酶劑量依賴性地預(yù)防DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

為了進(jìn)一步研究補(bǔ)充溶菌酶對(duì)腸道健康的有益效果，本文中研究者們?cè)u(píng)估了化學(xué)誘導(dǎo)（DSS誘導(dǎo)）的輕度結(jié)腸炎中的結(jié)腸損傷。設(shè)置了兩種劑量（1.0mg和0.4mg）的溶菌酶。在體重方面，發(fā)現(xiàn)接受1.0mg溶菌酶在對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠的有一定的保護(hù)作用（圖3a-b），而0.04mg劑量的溶菌酶雖然缺乏保護(hù)作用，但是仍能抑制腸道炎癥（圖3c-h）。研究者還在所有測(cè)量數(shù)據(jù)中觀察到一個(gè)高度一致的劑量依賴性趨勢(shì)（圖3a-h）。與對(duì)照組小鼠相比，1.0mg溶菌酶沒(méi)有引起結(jié)腸損傷或細(xì)胞因子水平的可測(cè)量變化，因此表明溶菌酶不影響健康小鼠的免疫穩(wěn)態(tài)（圖3c-h）。

4. 溶菌酶可以在一定程度上保護(hù)DSS誘導(dǎo)的微生物區(qū)系變化，并改變其預(yù)測(cè)功能

DSS誘導(dǎo)前，溶菌酶補(bǔ)充組和對(duì)照組的糞便微生物組成相似（圖4a）。而處理后（研究末期），研究者評(píng)估了回腸、盲腸和結(jié)腸中的腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表研究結(jié)果一致，這些部位的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化（圖4b）。與DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的結(jié)腸靶點(diǎn)一致，DSS刺激誘導(dǎo)了遠(yuǎn)端腸道的一致變化，但在回腸中只有輕微的變化（圖4b-c）。溶菌酶可以在一定程度上保護(hù)腸道微生物免受到DSS的影響（圖4b-c），對(duì)DSS相關(guān)的軌跡起到了保護(hù)作用，在Prevotella屬和Oscillospira屬中，被歸類為A. muciniphila的幾種ASV普遍減少，而研究者也觀察到R. gnavus的增加，從而使DSS刺激小鼠中的溶菌酶介導(dǎo)的改善情況與在HFD喂養(yǎng)小鼠中觀察到的特征相一致（圖4c-d）。腸道微生物群的預(yù)測(cè)功能與微生物群組成相似，在結(jié)腸樣本也是主要受溶菌酶的影響（圖4e和4k）。該研究確定了在HFD和DSS兩項(xiàng)研究中都存在的21條受調(diào)控的通路，其中13條均受到溶菌酶的調(diào)控。這些途徑持續(xù)影響與氨基酸和核苷酸/核苷相關(guān)合成，碳水化合物代謝的改變，以及涉及肽聚糖合成和成熟的三種不同的途徑。

圖4. 溶菌酶可一定程度上保護(hù)DSS對(duì)BALB/c小鼠微生物群組成的影響

5. 溶菌酶介導(dǎo)的緩解DSS誘導(dǎo)性結(jié)腸炎依賴于功能性的腸道微生物群

為了進(jìn)一步研究腸道微生物群在溶菌酶介導(dǎo)的保護(hù)中所發(fā)揮的作用，探尋溶菌酶與微生物的關(guān)系，研究者設(shè)計(jì)添加了微生物群耗盡小鼠的研究組，這類小鼠的癥狀與DSS誘導(dǎo)的腸道損傷類似。盡管研究結(jié)果顯示受DSS刺激的Vehicle組的小鼠體重沒(méi)有減輕，但出現(xiàn)了與之前觀察結(jié)果相似的結(jié)腸炎表型(圖5a-c)。每日溶菌酶補(bǔ)充對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸縮短和脾臟重量以及宏觀和微觀下的結(jié)腸炎評(píng)分都有很強(qiáng)的保護(hù)作用(圖5a-g)。重要的是，雖然抗生素本身并不足以在體外抑制溶菌酶的活性，但在微生物區(qū)系耗盡的小鼠中，溶菌酶并沒(méi)有發(fā)揮保護(hù)作用（圖5h-n），這些數(shù)據(jù)很明顯地說(shuō)明，溶菌酶對(duì)結(jié)腸炎的影響依賴于腸道微生物群。

圖5. 溶菌酶利用腸道微生物群來(lái)緩解DSS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠結(jié)腸炎

總結(jié)與結(jié)論

總而言之，通過(guò)16s擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)合其它病理與生化實(shí)驗(yàn)以及結(jié)腸炎癥狀，初步證實(shí)了A. alcalophilum來(lái)源的溶菌酶重塑了腸道微生物群組成及其預(yù)測(cè)功能，減少HFD誘導(dǎo)的腸道通透性和細(xì)菌入侵，以微生物和劑量依賴性地方式減少DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，該文章研究了此來(lái)源的溶菌酶對(duì)兩種不同品系的小鼠的有益影響。結(jié)合已發(fā)表的免疫調(diào)節(jié)特性，說(shuō)明溶菌酶在改善腸道健康方面值得進(jìn)一步研究以評(píng)估其臨床轉(zhuǎn)化的前景。

圖6 溶菌酶在HFD喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠和DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎BALB/c小鼠中的作用

參考文獻(xiàn)

1. Larsen, Ida S?gaard et al. “Fungal lysozyme leverages the gut microbiota to curb DSS-induced colitis.” Gut microbes vol. 13,1 (2021): 1988836.
doi:10.1080/19490976.2021.1988836

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