胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一，晚期極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其中胰腺癌肝轉(zhuǎn)移很常見。據(jù)柳葉刀雜志記載，胰腺癌確診后的五年生存率約10%，是預后很差的惡性腫瘤之一。所以臨床上獲得一種marker用于對胰腺癌患者做出早期診斷尤為重要。

中文題目：Hi-C+ATAC+Chip+RNA-seq多組學揭示胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中3D表觀圖譜

英文題目：High-resolution Hi-C maps highlight Open Access multiscale 3D epigenome reprogramming during pancreatic cancer metastasis.

期刊：Journal of Hematology & Oncology

IF：17.388

發(fā)表時間：2021.8

作者：Bo Ren

研究背景

近年來胰腺癌的發(fā)病率穩(wěn)步上升。盡管在大多數(shù)人類癌癥的治療方面取得了重大進展，但胰腺癌因為其遠端轉(zhuǎn)移導致其仍然是一種致命的惡性腫瘤。目前，遠處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為3%，遠低于局部病變患者。越來越多的表觀遺傳學知識表明，DNA甲基化和組蛋白修飾與胰腺癌病理生物學和亞型相關，并且它們在胰腺癌進展過程中發(fā)生顯著變化。然而，作為表觀遺傳學信息的一個組成部分，3D表

基因組在胰腺癌生物學中的作用，尤其是在其轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。

本文中，作者通過Hi-C、ChIP-seq、ATAC-seq和RNA-seq研究了來自正常胰腺上皮、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的細胞的高分辨率3D表觀基因組圖譜，來識別參與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關鍵基因。

結(jié)果

通過多組學技術，作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性胰腺癌細胞的Compartment A/B、TAD和loop環(huán)發(fā)生顯著變化，表明在胰腺癌轉(zhuǎn)移期間，大染色質(zhì)組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）修飾的異染色質(zhì)的重新編程、可伴隨compartment和TAD的重新編程，胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中增強子重編程可伴隨loop環(huán)的重新編程。同時，作者找到了胰腺癌轉(zhuǎn)移關鍵的候選基因LIPC在轉(zhuǎn)移癌中與特異性增強子成環(huán)，并在胰腺癌轉(zhuǎn)移病灶中顯著上調(diào)。GEO數(shù)據(jù)集和的IHC分析表明，與原發(fā)性胰腺癌和正常胰腺組織相比，LIPC在肝轉(zhuǎn)移中的表達更高。體內(nèi)體外實驗均顯示，LIPC可以促進胰腺癌的遷移、侵襲和EMT（上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）過程。該文章通過多組學分析構(gòu)建了一個完整的胰腺癌轉(zhuǎn)移過程的3D基因組圖譜，擴展了對胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中基因調(diào)控機制的認知。

材料與方法

材料：正常胰腺細胞（HPNE）、原發(fā)胰腺癌細胞（PANC-1）、肝轉(zhuǎn)移（Capan-1）的胰腺癌細胞；

方法：Hi-C、ATAC-seq、Chip-seq、RNA-seq、TCGA+GEO

研究內(nèi)容

一、Compartment重排與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關系

首先作者利用Hi-C數(shù)據(jù)通過Pearson相關矩陣的主成分分析確定了胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中的Compartment A/B及其變化。作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移和正常/原發(fā)性胰腺癌細胞之間的Compartment切換更為顯著[Capan-1與HPNE中的26.70%和Capan-1與PANC-1中的30.75%，正常胰腺導管和原發(fā)癌細胞之間的間隔切換16.17%]。

為了研究這些表觀遺傳學特征與A區(qū)和B區(qū)的劃分之間的關聯(lián)，作者測試了組蛋白修飾的相對水平和跨區(qū)的染色體可及性。發(fā)現(xiàn)A區(qū)具有更高的活性組蛋白修飾，包括H3K4me3、H3K27ac和H3K36me3。H3K9me3在HPNE和PANC-1細胞的B區(qū)室中顯著富集，而Capan-1細胞的B區(qū)室具有較高水平的H3K27me3富集。

作者對Compartment利用PC1值進行聚類分析，以確定正常和原發(fā)癌細胞的B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移癌細胞的A區(qū)室（圖1a），并且位于這些區(qū)室中的基因表現(xiàn)出更高的表達（圖1b）。GO富集分析結(jié)果顯示，這些基因富含Ras/small GTPase 、 oxidation–reduction term，而這些是胰腺癌進展所必需的。這些結(jié)果提示，Compartment重排可能促進胰腺癌的轉(zhuǎn)移。

圖1

二、胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中組蛋白修飾變化與TAD分裂

作者在HPNE細胞中鑒定出6398個平均大小為237kb的TAD，在PANC-1細胞中鑒定出6449個平均大小為247kb的TAD，在Capan-1細胞中鑒定出8580個平均大小為185 kb的TAD。有趣的是，Capan-1細胞中的TAD的大小變得比HPNE中的（p<0.0001，Wilcoxon秩和檢驗）和PANC-1細胞（p<0.0001，Wilcoxon秩和檢驗）中的小得多（圖2a）。同時發(fā)現(xiàn)正常和原發(fā)癌細胞的TAD邊界數(shù)量幾乎相同，但在胰腺癌轉(zhuǎn)移期間顯著增加，這與轉(zhuǎn)移癌細胞中TAD大小的減小相一致，表明胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中新的TAD邊界形成。

通過Chip數(shù)據(jù)分析，與轉(zhuǎn)移癌相比，原發(fā)癌具有更高的H3K27me3富集的特異性TAD，表明轉(zhuǎn)移過程中，非活性的TAD轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘腡AD。例如BCAT1基因，是重新編程支鏈氨基酸代謝所必需的，位于新的富含H3K36me3的TAD中（圖2d），并且其表達量顯著升高升高（圖2e）。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集顯示，BCAT1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌樣本中BCAT1表達上調(diào)（圖2f）（p=0.02，Student t檢驗），并且BCAT1表達與總生存率呈負相關（圖2g）（p=0.028，對數(shù)秩檢驗）。總之，這些結(jié)果表明，在胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中，結(jié)構(gòu)域的分裂可能與表觀遺傳狀態(tài)的改變相結(jié)合。

圖2

接下來，作者重點關注原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌細胞之間的共同結(jié)構(gòu)域。提取了位于共同結(jié)構(gòu)域中的基因，發(fā)現(xiàn)這些基因中的大多數(shù)在轉(zhuǎn)移癌樣本中上調(diào)，并且GO分析顯示顯著上調(diào)的基因（log2FC≥ 1和調(diào)整p值≤ 0.05）在血小板衍生生長因子受體信號通路中富集（圖3b）。此外，作者利用TCGA胰腺癌患者隊列的基因表達數(shù)據(jù)和長期隨訪數(shù)據(jù)來確定這些基因的表達與患者生存率之間的相關性。分析表明，這些基因的高表達顯著降低了患者的生存率（p=0.0175，對數(shù)秩檢驗）（圖3c）。例如，TGFA基因，位于原發(fā)癌富集H3K27me3的結(jié)構(gòu)域中，但位于轉(zhuǎn)移癌的富集H3K36me3的結(jié)構(gòu)域中。而這個基因的高表達顯著降低了患者的生存周期（圖3f）。也就是說，共同結(jié)構(gòu)域中的染色質(zhì)狀態(tài)改變也可促進胰腺癌轉(zhuǎn)移。

圖3

三、與轉(zhuǎn)移特異性增強子相關的基因與胰腺癌轉(zhuǎn)移和不良預后相關

通過loop環(huán)的分析，loop數(shù)量與TAD總體趨勢類似，在轉(zhuǎn)移細胞癌中顯著增加。與原發(fā)癌細胞相比，大多數(shù)啟動子與Capan-1特異性增強子成環(huán)的基因表達上調(diào)，同時，這些基因的表達水平明顯高于與PANC-1特異性增強子連接的基因。作者對顯著上調(diào)基因富集分析發(fā)現(xiàn)：這些基因在細胞遷移和血管生成方面顯著富集（圖4c），表明這些基因與胰腺癌轉(zhuǎn)移相關；而且生存分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的高表達與不良預后顯著相關（圖4d）。這些結(jié)果表明，胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中環(huán)的變化可上調(diào)轉(zhuǎn)移相關基因。

圖4

四、Hi-C鑒定LIPC為胰腺癌轉(zhuǎn)移促進基因

利用高分辨率Hi-C數(shù)據(jù)，作者篩選了了600多個與胰腺癌轉(zhuǎn)移相關的環(huán)重編程基因。結(jié)合GEO數(shù)據(jù)，定了3個交叉的關鍵基因，它們與Capan-1特異性增強子形成環(huán)，并在胰腺癌轉(zhuǎn)移組織中上調(diào)（圖5a）。作者重點關注脂肪酶C（LIPC）基因，其在所有對照組中的FC變化最大（Capan-1與PANC-1中為11.44，GSE71279中為1.54，GSE63124中為7.96，GSE42952中為4.34）。H3K27ac芯片序列分析顯示有7個候選增強子位于LIPC基因座旁。這些增強子與Capan-1中的LIPC基因環(huán)接，但不與PANC-1中的LIPC基因環(huán)接（圖5b），導致Capan-1中LIPC的表達升高。qPCR結(jié)果顯示，Capan-1中所有候選增強子和LIPC啟動子的表達水平升高（圖5c）。此外，3C qPCR檢測到Capan-1中LIPC啟動子和增強子之間有更強的相互作用（圖5d）。

為了測試LIPC對胰腺癌轉(zhuǎn)移的影響，作者過表達和干擾試驗，LIPC的過度表達促進了胰腺癌細胞的遷移和侵襲，但LIPC的敲除抑制了胰腺癌細胞的遷移和侵襲。原位異種移植腫瘤模型顯示，與Lv shNC組相比，Lv shLIPC組的腫瘤負荷顯著降低。LIPC沉默組的原發(fā)腫瘤重量、肝臟重量和有肝轉(zhuǎn)移的胰腺癌細胞也較低（圖5f-h）。

IHC實驗表明，肝轉(zhuǎn)移性胰腺癌組織的臨床標本中的LIPC表達。肝轉(zhuǎn)移中LIPC的表達明顯高于原發(fā)性胰腺癌。同樣，原發(fā)性胰腺癌中LIPC的表達高于癌旁正常胰腺組織（圖5i）。
以上結(jié)果表明，在胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中，環(huán)重編程導致LIPC上調(diào)，并從臨床和功能上證實了LIPC在胰腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。

圖5

五、參與轉(zhuǎn)移特異性增強子環(huán)接至啟動子的轉(zhuǎn)錄因子

在證明轉(zhuǎn)移特異性增強子的基因環(huán)與胰腺癌轉(zhuǎn)移相關后，作者想知道哪些因素有助于這些增強子啟動子環(huán)的形成。作者整合了ATAC-seq數(shù)據(jù)，分析了轉(zhuǎn)移癌中參與增強子啟動子成環(huán)的特異性增強子，確定TFs的motif，如SP1、EGR1和KLF5（圖6b）。相反，參與增強子啟動子成環(huán)的原發(fā)性胰腺癌特異性增強子的TFsmotif，如E2F1、MAZ和ZFX（圖6b）。位于相應啟動子的的這些motif分析結(jié)果與位于細胞類型特異性增強子的motif分析結(jié)果相似（圖6c）。值得注意的是，所有NDR都有CTCF和CTCFL motif，這與CTCF是介導染色質(zhì)環(huán)的重要染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白這一事實一致。

先前的研究表明KLF5對胰腺癌的進展至關重要，而在本次研究中，KLF5的motif在轉(zhuǎn)移特異性增強子和相應的啟動子處富集（圖6b-c）。RNA-seq分析顯示KLF5在轉(zhuǎn)移癌細胞中顯著上調(diào)（圖6d）。此外，通過TCGA數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)胰腺癌樣本中KLF5的表達高于正常樣本（圖6e），并且KLF5的高表達與胰腺癌患者的不良預后相關（圖6f）。利用多組學數(shù)據(jù)，作者確定了轉(zhuǎn)移癌細胞中KLF5啟動子區(qū)域的特有的幾個增強子（圖6g，黑色箭頭）。總之，轉(zhuǎn)移特異性增強子環(huán)到幾個關鍵TFs的啟動子，這些TFs可以介導額外的增強子啟動子成環(huán)來上調(diào)與胰腺癌轉(zhuǎn)移相關的基因。

圖6

結(jié)論

作者通過Hi-C圖譜強調(diào)了來源于肝轉(zhuǎn)移的胰腺癌細胞在不同染色質(zhì)級別上表現(xiàn)出顯著差異。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性胰腺癌細胞的Compartment重排更為明顯。此外，在胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中，TAD在基因組和表觀基因組上發(fā)生改變，其變得更小和更多，這與組蛋白修飾的變化有關。同時，作者發(fā)現(xiàn)3D表觀基因組重編程確實存在，并鑒定了600多個與胰腺癌轉(zhuǎn)移特異性相關的基因。并通過各種實驗，確定了關鍵候選基因LIPC在轉(zhuǎn)移癌中與特異性增強子成環(huán)，并在胰腺癌轉(zhuǎn)移病灶中顯著上調(diào)。LIPC可以促進胰腺癌的遷移、侵襲和EMT（上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）過程，這些結(jié)果強調(diào)了LIPC在胰腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，并證明3D表觀基因組重編程可以上調(diào)轉(zhuǎn)移促進基因以促進胰腺癌轉(zhuǎn)移。

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